Chromatographie
- Stoffgemische werden in der mobilen Phase auf einer stationären Phase weiterbefördert
- > aufgrund der WW zwischen der Probe, der M-Phase und der S-Phase werden einzelne Komponenten unterschiedlich schnell weiter transportiert und können so getrennt werden
- die unterschiedliche Verteilung der Moleküle sorgt für unterschiedliche Geschwindigkeiten
Prozesse der Chromatographie
- Herstellung des Flusses der mobilen Phase (durch Druck, Kapillar, elektrische Spannung)
- Injektion der Probe (vor dem FLuss der M-Phase oder währenddessen)
- Auftrennung auf der Trennstrecke durch WW
- Detektion (durch Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit)
Stationäre Phase
Phase, die mit den einzelnen Substanzen des Substanzgemisches Wechselwirkungen eingeht und sich nicht bewegt. Der Aufenthalt der Analyten bei ihrer Retention wechselt zwischen mobiler und stationärer Phase (random walk), und verursacht die substanzcharakteristische Retentionszeit.
Mobile Phase
Phase, in die das Substanzgemisch am Beginn des Trennsystems eingebracht wird und die bewegt wird (Phase an einem festen oder flüssigen Stoff). Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit („Stärke“ s. u. „Elutrope Reihe“), dies bedingt unterschiedliche Retentionszeiten und oft auch unterschiedliche Selektivitäten.
Retention
Verzögerung von einzelnen Substanzen des Substanzgemisches durch Wechselwirkung mit der stationären Phase.
Retentionszeit
Zeit, die die Moleküle eines reinen Stoffes zum Durchwandern der Säule benötigen (von der Injektion bis zur Detektion).
Durchflusszeit
Die Durchflusszeit (früher auch “Totzeit”) gibt die Zeit an, die die mobile Phase oder eine nicht zurückgehaltene Substanz benötigt, um die Säule zu durchwandern. Eine nicht zurückgehaltene Substanz (Inertsubstanz) befindet sich nur in einer vernachlässigbar geringen Konzentration in der stationären Phase und durchläuft die Säule daher in der selben Zeit wie die mobile Phase.
Elution
Elution (von lat. eluere „auswaschen“) ist das Herauslösen oder Verdrängen von adsorbierten Stoffen aus festen oder mit Flüssigkeit getränkten Adsorbentien und Ionenaustauschern durch kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels (Elutionsmittel = mobiler Phase). Die aus der Trennsäule fließende Lösung wird Eluat genannt.
Eluent
Mobile Phase, die die Trennstrecke passiert hat.
Van-Deemter Gleichung:
H = A + B/u + C * u
- beschreibt die Trennleistung in der Gas- und Flüssig-Chromatographie
- je kleiner H umso größer ist die Trennleistung des Systems
H= L/N
H - Bodenhöhe
L - Länge der Säule
N - Trennstufenzahl
u - lineare Trägergasgeschwindigkeit
A - Streudiffusion/Wirbeldiffusion (Eddy-Diffusion). Bei gepackten Säulen erhöht die Verwirbelung diese Konstante. Bei Kapillarsäulen entfällt dieser Term.
B - Longitudinal-Diffusion, Diffusion in Längsrichtung. Dieser Faktor ist abhängig von der Viskosität und Temperatur des Trägergases.
C - beschreibt den Massenübergang zwischen stationärer und mobiler Phase. Dieser Term wird durch die Art des Trägergases, die Art und Dicke der stationären Phase beeinflusst.
Der Term A ist von dem Teilchendurchmesser der stationären Phase abhängig: A = 2 λ d (λ = Faktor, d=Teilchendurchmesser).
Der Term B ist von dem Diffusionskoeffizient der mobilen Phase (D(M)) abhängig: B = 2 λ D(M).
Der Term C ist auch von dem Teilchendurchmesser, der Säulenlänge und dem Säulenradius sowie dem Diffusionskoeffizienten in der stationären Phase abhängig.
Gaschromatographie
- Verteilungschromatographie, die als Analysemethode zum Auftrennen von Gemischen in einzelne chemische Verbindung verwendet wird
- mobile Phase: Inertgas ( N, He, H)
- besteht aus Injektor, Trennsäule im GC-Ofen und Detektor
- Probe wird in einem niedrig siedenden Lösungsmittel eingespritzt und erhitzt
- Substanzen werden durch Trägergas in die Säule gedrückt
- Im GC-Ofen -> perfekte Temperierung (entweder isotherm oder Temperaturgradienten -> schnelle und weitgehende Trennung)
- Detektor erzeugt ein elektrisches Signal, wenn eine Substanz das Trennsystem verlässt
Injektion:
- Gas-Probe -> bei hoher Konzentration folgt Direkteinspritzung, bei niedrigen Konzentration folgt eine Vor-Konzentrierung, dann Einspritzung
- Flüssig-Probe -> Verdampfung, dann Direkteinspritzung, oder split/splitlose Einspritzung (während oder nach der Injektion verdampft), oder on-coloumn Injektion (Direktauftragung auf die Säule)
- Feste Probe -> Interessierende Substanz wird ausgelöst und dann als Flüssige Probe behandelt
Trennsäulen: (Kenngrößen: Säulenlänge- und Durchmesser)
- GSC -> gepackte Metall- oder Glassäulen von wenigen Meter Länge -> direkte Leitung über das Trägermaterial
- GLC -> Trägersubstanz mit dünner Schicht einer wenig Flüchtigen, zähflüssigen Flüssigkeit überzogen -> übernimmt Funktion der eigentlichen stationären Phase)
- Heutzutage meist mit Kapillarchromatographie gearbeitet -> kurze, dünne Glassäulen. Die Stationäre Phase kleidet die Säule von innen als dünner Film aus.
Detektoren:
- Flammenionisationsdetektor (FID)
- Wärmeleitfähigkeitsdetektor WLD/TCD)
- Stickstoff-Phosphor Detektor (NPD)
- Elektroneneinfangdetektor (ECD)
- Massenspektrometer (MSD)
Flammenionisationsdetektor
- Detektor für organische Verbindungen
- Messung der Leitfähigkeit einer Knallgasflamme zwischen zwei Elektroden
- Substanzen werden in die Flamme transportier -> ionisiert -> Elektronen werden aufgefangen -> Signal wird erfasst
- Meistverwendeter Detektor, bis zu 1000x empfindlicher als WLD
Wärmeleitfähigkeitsdetektor
- Metallblock mit zwei Zellen -> Vergleichsmessung:
- Eine Messzelle wird vom Trägergas aus der Trennsäule durchströmt, die andere Vergleichszelle vom reinen Trägergas (beide enthalten Heizdrähte)
- Alle Heizdrähte werden von einem elektrischen Strom durchflossen und dadurch erwärmt. Die Temperatur der Drähte, und damit ihr elektrischer Widerstand hängt von der Wärmeleitfähigkeit der Gase ab, die die Zellen durchströmen. Veränderungen in der Zusammensetzung des Gases verursachen Temperaturänderungen und damit eine Widerstandsänderungen in den Drähten der Messzellen.
- Temperatur der Vergleichszelle ändert sich nicht -> Messbarer Spannungsunterschied
Stickstoff-Phosphor-Detektor
Detektion von Stoffen, die Stickstoff oder Phophor enthalten, oder ungerade Elektronenzahl aufweisen -> Aufbau ähnelt FID
- Probe wird furch ein Wasserstoff/Luft-Plasma geleitet ohne CH-Atome zu ionisieren -> über der Düse befindet sich eine beheizte Keramikperle -> Alkali-Ionen der Perle und entsprechend gewählte Temp. sorgen für Ionisation der Stickstoff- oder phosphorhaltigen Verbindungen -> es fließt ein Strom, der proportional zur Menge der erzeugten Ionen ist
Elektronenauffangdetektor
- Detektion von Substanzen, die eine affinität für Elektronen haben
- durch radioaktiven Zerfall von Nickelisotop 63 entstehen sekundäre Elektronen
- Wird im Trägergas eine Probensubstanz mit hoher Elektronenaffinität mitgeführt, dann wird von diesem Stoff ein Teil der freien Elektronen eingefangen
- > wodurch eine Verringerung des Ionisationsgrundstroms und somit ein Detektorsignal entsteht
Massenspektrometer
-Erkennt und misst durch Konvertierung von Analyten in Gasphasenione
- Einige Analyten können mit Elektronen in Anionen umgewandelt werden (Elektronenfang oder chemische Einwirkung)
-> Gasphasenionen werden nach Masse / Ladungsverhältnis getrennt
normalerweise mit Quadrupol-Massenanalysator
Flüssigketschromatographie
HPLC - High pressure liquid chromatographie
- Trennmethode, als Mobile Phase dient eine Flüssigkeit
- Funktioniert gut mit Flüssigen Proben (food testing, environmental samples…)
Aufbau:
-Pumpe, Injektor, Säule, Detektor
- wird verwendet bei Proben für die GC nicht geeignet ist (Polymere, Biologische Verbindungen
- kann bei niedrigeren Temp. arbeiten
- Interaktionen mit M-Phase und S-Phase
- > starke Interaktion mit S-Phase (lange in Säule), starke Interaktion mit M-Phase (kurz in Säule)
- Analyt wird injiziert und mit der mobilen Phase durch die Säule, die die stationäre Phase enthält, gepumpt
- NP-HPLC: “normal phase” -> polare stationäre Phase -> polare Moleküle haben stärkere WW und bleiben länger in Säule
- RP-HPLC: “reversed phase” -> gängigste Methode -> unpolare stationäre Phase -> polare Moleküle verlassen die Säule schneller, wodurch die Retentionszeit für diese Moleküle erheblich verkürzt wird
Techniken der LC
- Adsorptions Chromatographie
- Verteilungschromatographie
- Ionenaustauschchromatographie
- Größenausschlusschromatograpihie
- Affinitätschromatographie
Detektoren:
- UV/VIS
- Lichtstreuung
- Fluoreszenz
- Leitfähigkeitsdetektor
- Massenspektrometer
Adsorptionschromatographie
- es kommt zur Trennung aufgrund der unterschiedlich starken adsorptiven Bindungen des Analyten zur stationären Phase
- man stellt sich einen Wettkampf zwischen den diversen Probemolekülen mit den Molekülen der mobilen Phase um die Haftstellen auf der Oberfläche der stationären Phase vor
- > dabei wirken die Moleküle der M-Phase als Vergleichsmoment
Verteilungschromatographie
Die chromatografische Trennung erfolgt durch multiple Verteilung: Der Analyt ist unterschiedlich gut in stationärer und mobiler Phase löslich. Je besser sich ein Analyt in der stationären Phase löst, desto länger hält er sich darin auf und desto weniger weit wird er folglich von der mobilen Phase transportiert. Umgekehrt wird ein Analyt, der besser in der mobilen Phase löslich ist, eine größere Strecke transportiert.
VGL. NP-HPLC, RP-HPLC
Ionenaustauschchromatographie
- Analyten werden durch Adsorption getrennt, dabei ist die stationäre Phase geladen, die Ladung bezieht sich auf das interessierende Ion
- Kation Austauscher -> Stationäre Phase ist negativ geladen (Anionen bleiben in Mobiler Phase)
- Anionenaustauscher -> Stationäre Phase ist positiv geladen( Kationen bleiben in mobiler Phase)
Größenausschlusschromatographie
- es gibt keine richtige Stationäre Phase
- Es gibt Poren, in denen sich Teilchen, die klein genug sind einlagern und damit eine längere Zeit in der Säule verbringen, während große Teilchen direkt daran vorbeiströmen und somit die Säule schneller verlassen
Affinitätschromatographie
- basiert auf biologischen Interaktionen (Substrat-Enzym, Antikörper-Antigen, Hormon-Rezeptor)
- einer der Partner wird unbeweglich als stationäre Phase in der Säule aufgetragen
- Die Probe wird injiziert und der Ligand bindet selektiv den Analyten
- > nach dem Durchlauf wird der Analyt mit einem neuen Lösungsmittel “herausgewaschen”
UV/VIS - Detektor
Moleküle werden mit Elektromagnetischen Wellen im Bereich des sichtbaren und ultravioletten Lichts bestrahlt. Valenzelektronen von beispielsweise p- und d-Orbitalen der äußeren Schalen werden angeregt. Anhand der Energieabsorption des untersuchten Moleküls erhält man Informationen über Bindungsverhältnisse im Molekül.
- Aufbau eines Zweitstrahls zum Vergleich
- > Selektion nach Wellenlänge -> Messlösung und Vergleichslösung werden bestrahlt (200-800 Nanometer)
- > Unterschiede der Intensität nach Brechung wird gemessen
Titration
Ist eine Methode bei der mit Hilfe einer Maßlösung die Konzentration einer unbekannten Lösung ermittelt wird. Dazu wird die Maßlösung Tropfenweise über eine Bürette bis zum ÄP zum Analyten hinzugegeben bis ein Umschlag von pH, Farbe oder anderen messbaren Größen zu erkennen ist.
Volumetrische Titration: Voulmenmessung während der Titration
Gravimetrische Titration: Messung der Masse, die zum Analyt gegeben wurde
Vorteile:
- kostengünstig
- einfaches Equipment
- hohe Genauigkeit
- leicht Automatisierbar
2 Typen von Titration:
- Direkte Titration
- Indirekte Titration
