ARN Interférence

Question 1

Qu’est-ce que le processus du ARNi?

Answer 1

• L’ARNi est un processus moléculaire organisé qui mène à la destruction ciblée d’un ARNm et/ou une inhibition de la traduction de cet ARNm cible. Il s’agit d’un processus post-transcriptionnel.
• Contrôle l’expression des gènes, ce qui peut avoir des conséquences fonctionnelles et phénotypiques importantes (prolifération, différenciation, apoptose)
• Des altérations dans l’expression des miRNA sont associés à des maladies métaboliques, des pathologies virales, et le cancer.
• Les miRNA peuvent être en circulation dans l’organisme, où ils peuvent servir de marqueur diagnostique

Question 2

Quelles sont les 2 activités essentielles du ARNi?

Answer 2

• La reconnaissance d’un ARNm cible → appariement Watson-Crick → médié par un petit ARN spécialisé (les microRNA, ou miRNA)
• La destruction de cet ARNm cible → activité nucléase

Question 3

Quelle est la nomenclature des miRNA?

Answer 3

miR-Chriffre
-miR: miRNA mature
-mir: pre-miRNA ou pri-miRNA
- Chiffre en odre croissant selon la date de se découverte

Question 4

Un précurseur peut donner quoi?

Answer 4

1. 2 miRNA en proportions égales ou en proportions inconnues
   
   • miR-142-5p (bras 5’), ou miR-142-s (vieilli)
   • miR-142-3p (bras 3’), ou miR-142-as (vieilli)
2. 2 miRNA en proportions inégales
   
   • miR-56 : le plus abondant
   • miR-56*: le moins abondant

Question 5

Quelle est la biogénèse des miRNA (voie canonique - linéaire)?

Answer 5

1) Synthèse du microARN primaire (pri-miRNA): transcription via ARNpolII/III dans le noyau
2) Maturation du pri-miRNA en microARN précurseur (pre-miRNA): par le complexe du microprocesseur, formé de Drosha et de DGCR8(Pasha)
3) Export: via exportin-5, Ran, GTP
4) Maturation en duplex: par Dicer et la protéine de liaison à l’ARNdb TRBP. Dicer laisse des extensions de 2 nt en 3’.
5) Le brin fonctionnel (guide) est chargé avec Ago2 sur le complexe RISC, alors que le brin passager est détruit. Ago2 reconnait les extensions 3’ du brin guide (domaine PAZ) et ouvre le duplex avec le
domaine N.
6) Activité ‘’slicer’’ des argonautes (Ago2) clive la cible (ARNm) avec activité ribonucléase.

Question 6

Quelle «erreur» peut-il y avoir dans la structure duplex en boucle du pre-RNA?

Answer 6

1. Renflement ou bulge, nucléotide ‘’flottant’’
2. Mésappariement ou appariement non-canonique (wobble)

Question 7

Quels sont les 2 types de brins qui peuvent être utilisé par RISC?

Answer 7

• 5’ = 5prime = 5p
• 3’ = 3prime = 3p

Question 8

Lequel des brins sera utilisé comme guide par le complexe RISC? Lequel sera le brin passager (dégradé, *)?

Answer 8

Les 2 formes (5p et 3p) peuvent en fait co-exister… Certains sont plus utilisés que d’autres, ça dépend du contexte, des séquences. Souvent, le brin le moins bien apparié en 5’ (mésappariement, bulge) est choisi comme guide.

Question 9

Où sont habituellement localisée les sites de liaisons aux miRNA dans les animaux?

Answer 9

Dans la région non traduite en 3’ des ARNm (3’UTR)

Question 10

Qu’est-ce que SEED?

Answer 10

Les nucléotides 2-8 en 5’ du brin antisens (guide) au sein du complexe RISC représentent la séquence ‘’seed’’, ce sont ces derniers qui vont interagir avec des séquences complémentaires dans les 3’UTR des ARNm.

Question 11

Quand est-ce que RISC est sollicité et quand est-ce qu’il ne l’est pas?

Answer 11

• Sollicité: S’il y a une complémentarité parfaite entre le toute la séquence du guide et la cible (pas juste la séquence seed), l’activité slicer de RISC est sollicitée et il y a dégradation du transcrit. Ceci arrive uniquement avec dessiRNA chez l’humain (voir plus loin).
• Pas sollicité: Le reste de la séquence présente peu de complémentarité, et fait en sorte que l’activité slicer de RISC n’est pas sollicitée. À la place, il y a recrutement de protéines GW qui interagissent avec les queues poly(A) et des complexes de déadénylation comme CCR4/NOT ou PAN2/3, ce qui mène à la répression de la traduction, la déadénylation, et la désintégration du cap en 5’. S’ensuit une dégradation 5’→3’

Question 12

Qu’est-ce que les siRNA? Quelles sont leurs caractéristiques?

Answer 12

Petits ARNs interférents:
- Produits par dicer à partir d’ARNdb viraux ou transfectés directement
- Complémentarité parfaite
- Cible spécifique
- Dégradation rapide

Question 13

Qu’est-ce que les miRNA? Quelles sont leurs caractéristiques?

Answer 13

• Produits natiuellement
• Complémentarité partielle
• Plusieurs cibles
• Bloque la traduction
• Dégradation + lente

Question 14

Qu’est-ce qu’une protéine Argaunaute? Quel est son rôle?

Answer 14

• Protéine sur le brin guide du siRNA ou d’un miRNA
• En cas de parfaite complémentarité via des siARN ou des miARN (ce qui est souvent observé chez les plantes), une protéine Argonaute catalytiquement active clive l’ARNm dans le cadre de RISC (à gauche).
• Comme les miARN chez les animaux ne sont que partiellement complémentaires de leurs ARN cibles, le clivage est altéré. Dans ce cas, Argonaute recrute un membre de la famille des protéines GW. Ces protéines médient l’interaction avec d’autres facteurs agissant en aval comme les protéines de liaison poly(A) (PABP) ou les complexes de déadénylase PAN2/PAN3 et CCR4/NOT. Cela conduit à la répression traductionnelle, à la déadénylation, au décapage et à la désintégration exonucléolytique 5’-3’ de l’ARNm.

Question 15

Quelles sont les méthodes de base qui permettent assez facilement d’utiliser la machinerie de l’ARNi à des fins expérimentales?

Answer 15

1) Les petits ARNs interférents (les siRNA) : ils miment un miRNA mature. Ils sont habituellement
synthétisés in vitro et appariés pour former un duplex. On les transfecte dans des cellules à l’aide
d’agents de transfection. Une alternative sont les petits ARNs interférents substrats de Dicer (DsiRNA), ils sont un peu plus gros.
2) Les ARN en petites boucles (les shRNA) : ils miment un pre-miRNA en boucle. Ils sont produits
par la cellule qui a auparavant été transfectée avec un plasmide ou autre vecteur permettant leur expression (vecteurs rétro ou lentiviraux).

Question 16

Pourquoi la conception des siRNAs est difficile et nécessite beaucoup de tests?

Answer 16

Car ils peuvent être toxiques:
1) L’ARNdb peut être reconnu par des senseurs de l’immunité innée comme la kinase PRK et les récepteurs tolllike (TLR3/7/8). Ceci peut être contourné des modifications chimiques de bases comme le 2’-O-methyl.
2) Les excipients (nanoparticules) peuvent se décomposer et causer de la toxicité et des réactions immunologiques liés à l’infusion intraveineuse. Ceci peut être amélioré avec des prétraitements aux corticostéroïdes et médications anti-allergiques, et nécessite une étude approfondie des formulations et une optimisation de leur stabilité.
3) Activité ‘’off-target’’ ou hors-cible. La séquence seed peut avoir un grand nombre de cibles. Ceci implique l’identification de cibles non désirées à l’aide d’outils bio-informatiques et des tests approfondis. Une diminution de la dose diminue souvent les effets hors cible.
4) Activité dans des organes non ciblés. Nécessite de trouver des gènes hautement sélectifs à certaines maladies, de trouver de nouvelles approches pour cibler certains organes.

Question 17

Qu’est-ce qui cause la grande fragilité des siRNA?

Answer 17

Les siRNA sont fragiles en soi à cause de leur liens phosphodiesters vulnérables aux RNAses plasmatiques.

Question 18

Qu’est-ce la fragilité des siRNA cause?

Answer 18

• Dans le sang, les siRNA sont chargés négativement, hydrophiles et facilement éliminés par les reins.
• Il faut les modifier chimiquement ou les formuler dans des nanoparticules pour augmenter leur
  demi-vie plasmatique.
• Les mêmes embûches que celles des ASOs sont retrouvées, comme l’incapacité à traverser la BHE

Question 19

Quelles sont les modifications possible afin d’améliorer le potentiel thérapeutique des siRNAs?

Answer 19

1. Au niveau du phosphate:
   
   • Phosphorothioate (PS): résistance aux nucléases, augmente la liaison aux protéines plasmatiques (albumine), ce qui augmente leur demi-vie plasmatique et leur entrée cellulaire. Il faut bien doser le nombre de résidus modifiés.
2. Au niveau du ribose:
   
   • 2’-OMe/2’-O-MOE: augmentent la stabilité en bloquant le groupe 2’OH nucléophile. Augmente l’affinité pour l’ARNm. Réduit l’immunogénicité dans le corps.
3. Au niveau de la base azotée:
   
   • Bases modifiées: peut diminuer la reconnaissance par des senseurs de l’immunité innée et augmenter la stabilité.