9.1. Welches sind die wichtigsten Chromatografiarten in der biopharmazeutischen Industrie. Nenne 5
- Gelfiltration
- Hydrophobe Interaktions Chromatografie
- Ionenaustausch
- Liganten Affinität
- Reversed Phase (unpolare stationäre Phase, polare mobile Phase)
9.3. Nenne eine sinnvolle Kombination von 3 Chromatographieschritten und erläutere warum diese gewählt wurde?
Bsp.: 1) Ionenaustausch (IEX)
- Ausnutzung der (schwachen) ionischen Eigenschaften und Konzentrierung großer Volumina möglich
2) Hydrophobic Interacion (HIC) - Durch Salze kann die hydrophobe WW von Proteinen gesteigert werden, beim eluieren aus der Säule wird die Salzkonzentration gesenkt, Proteine unterschiedlicher Hydrophobizität werden nacheinander ausgespült.
3) Gelfiltration (GF) - Verschiedene Proteine können nun durch ihre Größe getrennt werden. GF ist besonders bei kleinen Probevolumina geeignet und kann die Konzentration zudem verdünnen.
9.4. Wie funktioniert Größenausschlusschromatographie? Wie ist der Verteilungskoeffizient definiert? Skizziere eine typische Kallibrationsgerad die die Trennung verschieden großer Proteine beschreibt.
- Die Lösung wird in ein packed bed gegeben. Meist wird eine Agarose-gelmatrix mit sehr hohem Wasseranteil genutzt. Die Partikel in der Lösung gehen dabei keine direkte Wechselwirkung mit der Matrix ein. Allerdings ergeben sich durch die unterschiedliche Größe der Stoffe unterschiedliche Bewegungsmöglichkeiten durch die Matrix, so das große Partikel früh und kleine erst später eluiert werden.
- Kav=(Vemax-Vzwischrenraum)/(Vtotal-Vzwischenraum) sollte immer zwischen 0 - 1 liegen (Vemax=Vzwischenraum+Vpore)
- > Jakob
9.7. Ziel ist es Produkt A möglichst gut von den kontaminierenden Zellproteinen zu trennen. Produkt A hat einen pl von 3.0, die kontaminierenden Zellproteine sind durch einem pl zwischen 5-7 charakterisiert. Welche Chromatographieart würden sie wählen wenn das Produkt sehr verdünnt vorliegt. / das Produkt sehr instabil ist? Warum
- verdünnt: anionentauscher pH 3-5 Produkt bindet
- Instabil: kationentauscher 3-5 Protein bindet -produkt kommt nicht mit Oberflächen in Verbindung
9.10. Erkläre den grundsätzlichen Unterschied zwischen HIC und RP
Bei RP wird eine stark hydrophobe LIgandenfläche allmählich mit einem organischen Lösungsmittel neutralisiert. Je nach Hydrophobizität werden so die einzelnen Stoffe getrennt.
HIC hingegen erhöht die Salzkonzentration um eine Erhöhung der Hydrophobizität des Materials zu ermöglichen.
9.11. Wie sind Effizienz, Selektivität und Auflösung (Resolution) definiert. Skizziere für jeden Parameter.
Effizienz: Wie schmal ist der Peak, also wie dicht zusammen werden gleiche Stoffe beim Chromatographieren eluiert.
Selektivität: Wie weit liegen die Peaks auseinander? Wie gut werden unterschiedliche Stoffe getrennt.
Auflösung: Selektivität/Effizienz
9.12. Zeichne den van Deemter Plot und gib die Formel an.
H(u)=A+B/u+Cu
A=Eddy-Diffusion, linear und unabhängig von u
B=Längsdiffusion: je höher u, desto geringer der Einfluss
C=Massentransfer, je höher u, desto mehr Masse kann transferiert werden.
9.15. Nenne eine typische Kombination von Chromatographieschritten für die Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern.
- affinitätschromatographie
- weiter Schritte und fein aufzureinigen
-> da die affinitätschromatogrphie so selektiv ist bei Antikörpern macht es Sinn die Kosten in Kauf zu nehmen.
9.16. Nenne drei unterschiedliche Aufbauten von Adsorbermaterialien! Welche Vor und Nachteile bieten diese?
- Monolithic column: lange und dünne Säulen, keine Limitationen durch Diffusion aber nur geringe Kapazität
- Packed Column: Mischung aus porösem und nicht porösem Material, geeigent für analytische sowie präparative Chromatographie
- Membrane Stack: keine Limitationen durch Diffusion, hohe Kapazitäten, geringer Gegendruck
9.17. Skizziere eine typische Adsorptionsisotherme und eine Adsorptionskinetik
-> Jakob
9.18. Wie ist das experimentelle Vorgehen bei der Bestimmung von lsotherme und Kinetik!
Isotherme: Mehrere Proben mit gleicher Menge Adsorbermaterial werden für einige Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an Proteinen gemischt, um so den Quotient Protein/Adsorber zu bestimmen.
Kinetik: Gleiche Menge an Adsorber und gleiche Konzentration an Proteinen werden in mehreren Messreihen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Das verbleibende freie Protein wird gegenüber der Zeit aufgetragen.
9.19. Wie ist der HETP Wert definiert? Gib die Formel an und Beschreibe!
Height of a theoretical Plate. HETP=L/N mit Säulenlänge L und berechnetem N aus der Effizienz der Säule
(𝑁=16(𝑡𝑟/𝑤𝑏)²=5.545(𝑡𝑟/𝑤ℎ)²)
Je besser die Effizienz, desto größer wird N.
Wb=Breite des peaks an der Basis, wh=Breite des Peaks in der Hälfte
9.20. Welche Einteilung von Salzen gibt es die ihre Wirkung bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie beschreibt. Nenne beide Gruppen und je ein typisches Salz dieser Gruppen.
Kosmotrope (wirken stabilisierend): K2SO4
Chaotrope: (destabilisieren): KSCN
9.22. Warum verwendet man Size Exclusion Chromatography (SEC) in der Regel am Ende eines Prozesses und nicht am Anfang?
Muss in der Regel im Batchbetreib gefahren werden, und kann nur kleine Probevolumina verarbeiten.
9.23. Beschreibe den Prozess des Umpufferns mittels SEC…alle Prozessschritte angeben.
Die Säule wird mit dem neuen Puffer durchspült und gefüllt. Auf diesen wird dann die Probe gegeben. Die Partikel der Probe sind größer als die Moleküle des oberen Puffers. Sie gehen also schneller durch die Säule und kommen am Ende im mit dem neuen Puffer aus der Säule.
9.24. Warum binden Proteine an hydrophobe Oberflächen? Thermodynamische Erklärung!
Die Hydrophoben Flächen der Proteine und der Liganden werden von einer geordeneten Wasserschicht umgegeben. Um die Entropie zu erhöhen, muss die maximale Fläche dieser geordneten „Schalen“ reduziert werden. Die Proteine lagern sich an die Liganden.
9.25. Nenne drei typische HIC Liganden
Phenyl, Butyl, Ether
9.26. Warum wird Ionentauscher Chromatographie gerne mit hydrophober lnteraktionschromatographie kombiniert? In welcher Reihenfolge (Begründe)?
IEX->HIC.
- Für das Ablösen der gebundenen Stoffe wird der Salzgehalt erhöht. Dieser kann in der HIC genutzt werden da hier mit hohem Salzgehalt begonnen und dann gesenkt wird.
- Im Ioneneaustauscher wird die Prozesslösung gereinigt. So passieren weniger Nebenraktionen beim HIC
9.27. Was ist Affinitätschromatographie? Nenne 4 Ligand-Produktpaare in der Affinitätschromatographie
Affinitätschromatographie nutzt die spezifischen WW zwischen Biomolekülen und Liganden aus. Durch Änderung der Konditionen (pH…) kann diese Bindung wieder gelöst werden. Dadurch können große Volumina bearbeitet und stark aufkonzentriert werden.
Protein A: Fc region of IgG
Protein G: Fc region of IgG
Cibacron Blue: Broad range of enzymes, serum albumin
Procion Red: NADP+ dependent enzymes
Lysine: Plasminogen, ribosomal RNA
9.28. Wie wird In der Regel bei Affinitätschromatographie eluiert? Begründe!
Eluiert = Abtrennung des Produkts
- Änderung der pufferzusammensetzung welche die Bindung aufbricht ohne das Produkt oder Ligand zu beschädigen.
- extreme pH Änderung oder hohe konzentration von chaotrophen Stoffe.
Kann zu temporäre oder langfristigen Schäden führen. - spezifische Substanzen werden zugegen die in besserer Konkurrenz zum Liganden oder Produkt stehen. -> fast unmöglich auszureinigen
9.29. Nenne typische Eigenschaften der Anfangsund Endbedinguengen von „_ Prozesslösungen für die vier wichtigsten Chromatographiearten.
GF: kleines Volumen -> verdünnte Probe. Pufferänderung
IEX: niedrige ionische Kräfte(wenig Salz) -> hohe ionische Kräfte. pH Änderung
HIC: hohe ionische Kräfte-> niedrige ionische Kräfte
AC: spezifische bindungs Bedingungen-> spezifische ablöse Bedingungen
9.32. Welche Chromatographieart wird in der Regel verwendet um DNA abzureichern. Bei welchem pH wird der Prozess gefahren?
Anionentauscher
PH größer als 2 und kleiner als der pi der kontaminanten (wirtszellen etc)
9.33.Man kann unter bestimmten Bedingungen die Beladung einer Chromatographiesäule deutlich erhöhen wenn vor der Beladung die Prozesslösung auf konzentriert wird. Unter welchen Bedingungen funktioniert dies, unter welchen nicht? Begründe!
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