Quelles sont les deux phases du principe de chromatographie? Décrit-les.
La phase mobile contient le mélange de substances à fractionner.
La phase stationnaire est celle au travers de laquelle les substances sont séparées.
Quel est le principe de chromatographie?
Ce sont des substances qui intéragissent avec la phase stationnaire et leur migration est plus ou moins ralentie selon les propriétés de chaque substance.
Quels sont les types de chromatographies et dans quelles circonstances les utilise-t-on?
- La chromatographie par échange d’ions (interactions ioniques)
- La chromatographie par gel filtration (taille)
- La chromatographie d’affinité (spécificité)
Un échangeur d’anions porte des groupes de quelle charge?
De chage positive
Un échangeur de cations porte des groupes de quelle charge?
De charge négative
Dans la chromatographie par échange d’ions, est-ce que la liaison est réversible ou irréversible?
Réversible
Quels sont les 2 éléments qui dictent l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions? Pourquoi?
- Le pH de la solution parce que la charge nette des protéines varie selon le pH
- La nature et les concentrations des autres ions en solution qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions.
Qu’est-ce qu’une matrice dans la chromatographie?
Ce sont des polymères insolubles préparés sous forme de billes qu’on appelle aussi résines.
Quel est le polymère le plus utilisé pour composer les matrices des chromatographie par échange d’ions?
Les polysaccharides comme le cellulose ou ses dérivés, de l’agarose ou d’autres polymères.
Quelle caractéristique important possède les polymères composant la matrice dans la chromatographie par échange d’ions?
Ils sont poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine.
Les échangeurs utilisés en chromatiographie par échange d’ions dépendent de deux caractéristiques importantes. Lesquelles?
- La nature de leur matrice
- Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine.
Chaque classe d’échangeurs (anioniques ou cationiques) se divise en deux groupes. Lesquel?
-Les échangeurs forts: restent pleinement chargés entre un pH de 3 et 10
-Les échangeurs faibles: chargés dans une gamme de pH plus restreint
Comment se lient les protéines sur les échangeurs d’ions?
Par forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupement chargés sur l’échangeur
Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (métalliques, sel, tampon). Que doit faire la protéine dans ce cas?
Elle doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer.
Lors de la chromatographie par échange d’ions, après la liaison à la colonne, quelle est la deuxième étape?
Le lavage de la colonne à l’aide d’une solution tampon
Vrai ou faux.
Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée.
Vrai
Lors de la chromatographie par échange d’ions, après le lavage de la colonne, quelle est la troisième étape? Explique.
L’élution consiste à éluder les protéines liées à l’échangeur d’ions par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage.
Quels sont les deux sels utilisés principalement pour l’élution d’une protéine?
Le Nacl et le KCl
Que fait le sel lors du processus d’élution?
Il déplace la protéine en occupant les sites chargés de sorte que la protéine ne peut plus se rattacher et tombe.
Décrit la concentration saline utilisée pour le procédé d’élution fractionnée.
La concentration saline augmente à chaque élution.
À quoi sert la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire?
Pour séparer les molécules selon leur taille et forme.
Quels sont les trois grands principes de la méthode de chromatographie par gel-filtration?
- La phase stationnaire est composée de résine sous forme de billes
- Les pores de billes du gel sont assez grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais pas les plus grosses
- Les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores (grosses) traversent la colonne plus rapidement que celles qui sont retenues.
Quelle est l’unité de mesure de la masse des protéines?
En Daltons (Da) ou en kilodaltons (kDa)
Dans la chromatographie par gel-filtration, quels sont les polymères les plus communément utilisés pour façonner les matrices?
Les polysaccharides comme le dextrine, l’agarose ou le polyacrylamide
