Cours 2 - Méthodes d'analyses

Question 1

Quelles sont les trois composantes de la taxinomie microbienne (approche polyphasique) ?

Answer 1

Génotypique
Phénotypique
Phylogénétique

Question 2

Qu’est-ce qui est considéré comme une espèce en systématique microbienne ?

Answer 2

Population d’individus :
monophylétiques (même ancêtre)
cohérentes génomiquement et phénotypiquement
différenciables des autres espèces

Question 3

Quels aspects phénotypiques sont les plus utiles pour identifier une espèce microbienne ?

Answer 3

Approche ciblant le phénotype - Métabolisme (sucres, sources d’azote, fermentation), données physiologiques (optima enzymatiques), composition en acides gras.

Question 4

Le séquençage est-il toujours nécessaire pour identifier une espèce ?

Answer 4

Non, car le phénotype peut souvent suffire à différencier des espèces.

Question 5

***Quels sont les 4 classes d’analyses de génomes microbiens?

Answer 5

• Analyses génotypiques
• Techniques en génomique
• Génomique comparative
• Métagénomique

Question 6

Donne 3 outils ou techniques d’analyses génotypiques

Answer 6

• Hybridation ADN-ADN
• Pourcentage G-C
• Séquençage génomique par analyse globale

Question 7

Quelle valeur d’hybridation ADN-ADN indique une même espèce ?

Answer 7

≥ 70 %.
(Entre 25–70 % = même genre, < 25 % = pas apparentés).

Question 8

Quel est l’avantage d’utiliser une technique d’hybridation d’ADN-ADN?

Answer 8

Permet de discriminer les organismes les plus proches

Question 9

Comment calculer la valeur % C-C?

Answer 9

C’est une valeur déterminée à partir de la valeur du Tm étant la température à laquelle 50 % des molécules d’ADN double brin sont dénaturées (séparées en simple brins). La valeur est identifié à partir du point d’inflexion de l’absorbance qui augmente en fonction de la température.

Sera plus élevée si ADN riche en G+C (3 liaisons H au lieu de 2 pour A-T).

Question 10

Que mesure le % G+C d’un génome ?

Answer 10

La composition en bases (proportion guanine + cytosine).
→ Si différence > 5–10 %, organismes probablement non apparentés.

Question 11

Quelle était l’ancienne méthode de séquençage des génomes ?

Answer 11

Shotgun sequencing + clonage → séquençage Sanger.

Question 12

Qu’apportent les méthodes NGS (Next Generation Sequencing) ?

Answer 12

Séquençage massif, rapide, sans clonage, plus précis.

Question 13

Pourquoi le gène 16S rRNA est-il utilisé comme chronomètre moléculaire ?

Answer 13

Présent chez tous les organismes
Même fonction universelle
Évolution lente et conservée
Taille adéquate (>1500 pb)
Pas soumis au transfert horizontal

Question 14

Que permettent les amorces universelles ?

Answer 14

Amplifier le 16S rRNA de nombreux procaryotes avec la même paire d’amorces.

Question 15

Comment interpréter la longueur des branches d’un arbre phylogénétique ?

Answer 15

Elle est proportionnelle à la distance évolutive entre espèces.

Question 16

Quelles sont les limites d’un arbre phylogénétique basé uniquement sur les séquences ?

Answer 16

• Homoplasie (mutations récurrentes donnant faussement la même séquence au fil du temps)
• Le transfert horizontal de gènes peut biaiser l’analyse

Question 17

Sur quoi repose le MLSA (Multilocus Sequence Analysis) ?

Answer 17

Comparaison de 5 è 6 gènes « housekeeping » (ex. gyrA, recA, rpoD) qui évoluent lentement et sont constitutifs afin de détecter les souches qui sont proches

Question 18

Avantage du MLSA par rapport au 16S rRNA ?

Answer 18

Pouvoir de résolution plus fin que le séquençage de l’ARN 16S, permet de distinguer des souches très proches.

Question 19

Que permet la génomique comparative ?

Answer 19

Détecter des similitudes ou des sections homologues, des différences, déduire la fonction des gènes, définir les filiations entre espèces.

Question 20

Qu’est-ce qu’un ORF (Open Reading Frame) ?

Answer 20

Portion d’ADN ayant les caractéristiques d’un gène codant (initiation, codons stop, RBS…).

Question 21

Comment détecter un transfert horizontal de gènes ?

Answer 21

Présence de gènes atypiques :
- ORF avec des codons différents différents du reste du génome
- Fonctions inhabituelles (pourrait indiquer îlot de pathogénicité - transfert horizontal)
- Gènes proches d’espèces éloignées (pouvant indiquer transfert horizontal)

Question 22

Qu’est-ce que la métagénomique ?

Answer 22

Étude collective des gènes d’une communauté microbienne sans isolement d’individus.

Question 23

Quelle est la limite de la métagénomique ?

Answer 23

Ne permet pas toujours d’identifier précisément les espèces présentes, certains acides nucléiques peuvent être plus difficiles à extraire

Question 24

Quelles sont les étapes officielles de description d’une nouvelle espèce bactérienne ?

Answer 24

1. Isolement et caractérisation (morpho/physio/génétique)
2. Comparaison avec espèces connues
3. Choix du nom scientifique (binomial, ICNP)
4. Désignation d’une souche type (dans 2 collections)
5. Rédaction et publication (IJSEM)
6. Validation officielle par ICSP/IJSEM.

Question 25

Dans quel contexte est-il pertinent d'effectuer une analyse utilisant des techniques dégageant des traits phénotypiques?

Answer 25

Analyses en labo Confirmation rapide

Question 26

Dans quel contexte est-il pertinent d'effectuer une analyse utilisant des techniques dégageant des traits génotypiques?

Answer 26

Peut être pertinent dans un contexte où l'on veut différencier des espèces qui semblent proches avec des techniques %GC, hybridation ADN-ADN, 16S

Question 27

Dans quel contexte est-il pertinent d'effectuer une analyse génomique via le NGS?

Answer 27

Lorsqu'on vise à faire une analyse fine du génome complet , effectuer une étude de la fonction des gènes + cartographie

Question 28

Dans quel contexte est-il pertinent d'effectuer une analyse génomique comparative?

Answer 28

Quand on veut: - Déceler des différences et similitudes d'organisation structurale - Déduire la fonction des gènes - Agencer les espèces les unes par rapport aux autres - Définir une filiation

Question 29

Dans quel contexte est-il pertinent d'effectuer une analyse métagénomique ?

Answer 29

Pertinent lorsqu'on travaille avec des échantillons environnementaux

Question 30

Quelles sont les étapes de construction d'un arbre phylogénétique?

Answer 30

1. Amplification et séquençage du gène de l'ARNr 16S 2. Alignement des séquences via logiciel 3. Calcul de la distance évolutive : + les séquences d'ARNr sont différentes, plus la distance évolutive est grande 4. Construction de l'arbre à partir des distances évolutives calculées

Question 31

Que représentent les noeuds dans un arbre phylogénétique?

Answer 31

Indique où les espèces ont divergé selon un critère (souvent séquence de l'ARNr) permettant une différenciation

Question 32

Comment fonctionne le séquençage par la méthode de Sanger?

Answer 32

C’est une technique de séquençage d’ADN basée sur l’incorporation aléatoire de didésoxynucléotides (ddNTPs) qui stoppent l’élongation de la chaîne d’ADN, permettant de déterminer l’ordre des bases.

Question 33

Comment fonctionne la technique par hybridation ADN-ADN?

Answer 33

Nécessite deux set d'ADN d'organismes, l'un de référence et l'autre inconnu. Celui de référence doit porter un phosphate radiomarqué. Le contrôle est composé d'ADN marqué, considéré 100%. 1. Chauffe les échantillons d'ADN séparément pour que les db deviennent sb 2. Mélange les deux ADN et l'ADN qui ne porte pas le phosphate doit être en excès par rapport à l'autre 3. Isole les db qui se sont réhybridés 4. Par scintillateur on estime la proportion de réhybridés vs le contrôle, si identique à 25% près, même espèce.

Question 34

Comment fonctionne le shotgun sequencing?

Answer 34

C’est une méthode de séquençage où le génome est fragmenté en morceaux aléatoires (shotgun), qui sont ensuite séquencés individuellement. Les séquences obtenues sont assemblées par bioinformatique pour reconstituer le génome complet.

Question 35

Qu'est-ce que le NGS?

Answer 35

Next-Generation Sequencing : ensemble de technologies de séquençage à haut débit permettant de lire des millions de fragments d’ADN en parallèle.

Question 36

Quelles sont les étapes pour effectuer une analyse par génomique comparative?

Answer 36

1. Assemblage : aligne et fusionne les fragments des lectures en se fiant au génome de référence 2. Annotation : identifie les gènes putatifs et les régions fonctionnelles, ORF

Question 37

Quelles sont les principales étapes du whole-genome shotgun sequencing ?

Answer 37

1. Extraction de l’ADN génomique. 2. Fragmentation aléatoire en petits morceaux. 3. Insertion dans des vecteurs (plasmides, BACs) et clonage (ou amplification PCR). 4. Séquençage des fragments. 5. Assemblage informatique par chevauchement des séquences.

Question 38

Quels sont les avantages du shotgun sequencing ?

Answer 38

- Rapidité par rapport à la stratégie hiérarchique. - Ne nécessite pas d’étape d’ordonnancement préalable des clones. - Permet le séquençage de grands génomes.

Question 39

Quels sont les inconvénients du shotgun sequencing ?

Answer 39

- Assemblage complexe pour les génomes avec beaucoup de répétitions. - Peut nécessiter une grande puissance de calcul.

Question 40

Quelle est la différence entre un dNTP et un ddNTP pour la méthode de Sanger ?

Answer 40

dNTP : possède un groupement –OH en 3’, permettant l’élongation de la chaîne. ddNTP : manque le –OH en 3’, provoquant la terminaison de la chaîne lors de son incorporation.

Question 41

Quelles sont les principales étapes de la méthode de Sanger classique ?

Answer 41

1. ADN matrice sb + Amorces spécifiques + ADN polymérase + Mélange de dNTPs normaux 2. Sépare mélange 4 tubes avec l'ajout d'UN ddNTPs marqués 3. Réactions de synthèse → production de fragments de longueurs variées selon où la réaction a été stoppé par ddNTP 4. Séparation par électrophorèse. 6. Lecture de la séquence selon les puits (G,A,T,C) en partant du bas du gel.

Question 42

Comment étaient marqués les fragments dans la méthode de Sanger originale vs moderne ?

Answer 42

Originale (années 1970–80) : ddNTPs marqués radioactivement, nécessitant 4 réactions séparées (A, T, G, C). Méthode moderne ddNTPs fluorescents avec une couleur différente pour chaque base

Question 43

Quels sont les avantages de la méthode de Sanger ?

Answer 43

Très grande fidélité (faible taux d’erreur). Méthode robuste et éprouvée

Question 44

Quels sont les inconvénients de la méthode de Sanger ?

Answer 44

- Lente et coûteuse pour les grands génomes. - Faible débit comparé aux techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS).

Question 45

Quelles sont les étapes générales du séquençage NGS ?

Answer 45

1. Fragmentation de l’ADN. 2. Ajout d’adaptateurs (pour fixation et amplification). 3. Amplification clonale (PCR en cluster ou en émulsion). 4. Séquençage par synthèse (ou autre chimie). 5. Lecture optique/électrique. 6. Assemblage bioinformatique.

Question 46

Qu’est-ce que la “library preparation” en NGS ?

Answer 46

C’est la préparation de l’échantillon d’ADN : fragmentation + ajout d’adaptateurs universels permettant la fixation à la surface de la puce (Illumina) ou la reconnaissance par le système de séquençage.

Question 47

Qu’est-ce qu’un read en NGS ?

Answer 47

Une séquence obtenue à partir d’un fragment d’ADN lors d’un cycle de séquençage. Des millions de reads sont produits puis assemblés.

Question 48

Quels sont les avantages du NGS ?

Answer 48

- Très haut débit (millions à milliards de bases lues en une seule expérience). - Coût par base très faible. - Permet le séquençage d'échantillons environnementaux et d’analyses complexes (RNA-seq, ChIP-seq, etc.).

Question 49

Quels sont les inconvénients du NGS ?

Answer 49

- Lectures courtes - Assemblage difficile pour les génomes riches en répétitions. - Demande de fortes capacités bioinformatiques.

Question 50

Quelles sont les applications majeures du NGS ?

Answer 50

- Séquençage de génomes entiers (WGS). - Transcriptomique (RNA-seq). - Métagénomique (microbiomes).