Diagnostik

Question 1

Vilka indirekta metoder har vi för att upptäcka en infektion?

Answer 1

• Serologi – Diagnostik för påvisning och kvantifiering av ex bakterie- och virusspecifika antikroppar
  
  • Antikroppar kan lätt korsreagera men är bättre på att finna om det finns (inte lika specifik
• Klinisk bild (ringrodnad på huden ex)

Question 2

Vilka direkta metoder har vi för påvisning av infektion?

• Direkt metodik är mer specifik

Answer 2

• Mikroskopi
  
  • Elektronmikroskop (virus)
• Odling (cellkultur) – bra bevis för infektion
• Molekylärbiologisk – detektion av gener/genfragment

Question 3

Nämn minst två typer av serologi

Answer 3

• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
  
  • Detektera och kvantifiera antikroppar
• Immunofluorescent antibody assay (IFA)
  
  • Detektion av antigen med hjälp av antikroppar
• Immunoblot (specifika proteiner med hjälp av antikroppar)

Question 4

Nämn minst tre molekylärbiologiska metoder vid diagnosticering av infektion

Answer 4

• Konventionell PCR
• Realtids-PCR
• Microarray (genuttyck eller genotypning (karaktäriserar olika typer virus/bakterier/svamp)
• DNA-sekvensering (sammansättning av kvävebaserna A,T,G,C - genotypning)

Question 5

Vilka för- och nackdelar finns med serologi?

Answer 5

• Fördelar: snabb, enkel, billig
• Nackdelar risk för korsreaktion, svårt särskilja på aktiv och tidigare infektion

Question 6

Vilka för- och nackdelar finns med molekylärbiologisk metod vid infektion?

Answer 6

• Fördelar: snabb, känslig
• Nackdelar: kan inte särskilja på levande och döda organismer (DNA som DNA liksom), känslig för kontamination

Question 7

När kan PCR vara lämpligt vid undersökning av hepatit B?

Answer 7

• PCR kan detektera i inkubationsfasen, akut och kronisk (röd färg) genom HBsAg men alltså inte vid utläkt eller vaccination (inget virus kvar)
  
  • Kan då också kvantifieras (Realtids-PCR), mängden viktigt vid smittsamhet och även uppföljning av behandling (sjunkande titer)

Question 8

När kan PCR vara viktigt vid hepatit C?

Answer 8

• Påvisa antikroppar mot HCV i blod (serologi) – måste vänta ett tag
• PCR bedömer smittsamhet efter fynd eller icke fynd av HCV-RNA i blodprov
• Påvisande av HCV-RNA är också viktigt för att påvisa HCV-infektion när antikroppar saknas, vilket kan ses hos individer med dålig antikroppsproduktion (t ex dialys patienter) eller tidigt i förloppet
  
  • (Genotypning när HCV-infektion har påvisats)

Question 9

Vilka diagnostik kan vara lämplig vid HIV för upptäckt och uppföljning?

Answer 9

• Serologi – påvisas antikroppar/antigen mot HIV i blod – snabbtest (antikroppstest) (30 min)
  
  • Om provtagning sker tidigt i förloppet kan visa falsk negativt resultat – upp till 6 veckor efter smittotillfälle
• PCR – tidig HIV-infektion (primär) kan bekräftas genom HIV-RNA – högre sensitivitet än HIV-antigentestet; blodprov tagna 1-2 veckor efter smittotillfället
• Realtids-PCR – kvantitativ HIV-RNA-analys används för att följa förloppet av infektionen, ta ställning till behandling och för att bedöma effekten av behandling
  
  • Ökande HIV-RNA nivåer vid behandling kan tyda på resistensutveckling

Question 10

Vilka diagnostiska metoder kan vara lämpligt vid fästingburen encefalit (TBE)?

Answer 10

• PCR – i tidigt skede (ovanligt) och om patienten haft fästingbett
• Serologi med antikroppspåvisning i serum eller likvor

Question 11

Vilken typ av metodik är numera standard vid diagnosticering av flertalet virusinfektioner och på vilket sätt kan den vara viktig vid behandling?

Answer 11

• qPCR (realtids) metod nu standard (om tillgänglig) för diagnosticering av flertalet virusinfektioner – om välgjord betydligt mer känslig och specifik än alla andra metoder
• Kan kvantifiera – värdefull för att undersöka effekt av ex antiviral behandling

Question 12

Säg en stor brist som finns vid diagnosticering med PCR

Answer 12

• Mutationer i patogenen kan ge felaktigt negativt svar (gäller all PCR)

Question 13

Hur gör du en “vanlig” PCR?

Answer 13

1. Lysera/förstöra celler; bakterier, virus, parasiter
   
   1. Mekaniskt
   2. Kemiskt
   3. Enzymatiskt
2. Rena fram nukleinsyror (för att bli av med andra proteiner som kan störa)
   
   1. pH
   2. Etanol/isopropanol
3. Tillägg av nödvändiga reagens
   
   1. Templat (DNA/cDNA (RNA som transkriberats till cDNA)
   2. Två eller fler primers (komplementära till målsekvens du vill amplifiera)
   3. Byggstenarna (adenin, guanin, cytosin, tymin
   4. Buffer (olika joner etc, ex magnesium som stabiliserar DNA och påverkar effektivitet på DNA-polymeras
   5. DNA-polymerase (Taq-polymerase), tål hetta (95 %) thermus aquaticus (lever i heta källor)
4. PCR ”Thermal cycling”
   
   1. Denaturering genom 95 C grader, Primer binder (aneling) sedan vid vid 50 grader och sedan höjs temp och DNA-polymeras kan transkribera vid 75 C grader, sedan börjar cykeln om och amplifiering sker – 40 cykler –> miljarder
   2. Men i och med att det blir exponentiellt så blir det svårare att hitta primers och nukleotider. DNA-polymeras blir också trött så exponentiell ökning av PCR-produkter saktar ned
5. POST-PCR
   
   1. Verifiering av PCR-produkt med elektrofores. Denna är den vanliga alltså PCR
   2. Gel-elektrofores för att se att
      
      1. Att en produkt bildats
      2. Rätt storlek (referensstege)
      3. Om ospecifik amplifiering bildats

Question 14

Hur fungerar realtids-PCR?

Answer 14

• Tänk att vi startar med fyra ggr mer DNA-templat än innan så skulle vi nå 1 miljon kopior två cykler tidigare (grön kurva), amplifieringskurvan skulle då förskjutas till vänster alternativt att vi startade med mindre då skulle vi nå samma nivå senare (blå kurva)
• Referensstandard
  
  • Vi har sju olika rör, där vi har målsekvens vi vill amplifiera
    
    • Extern standard (ofta plasmider) med känd koncentration används, där vi sätter in målsekvens i plasmid
  • 10-7 till 10-1 i denna referens
• Och om okänt prov dyker upp emellan någon av dessa kan vi säga att den innehåller mellan 1000-10 000, på detta sätt kan vi kvantifiera

Question 15

Så hur kan vi mäta hur många DNA-kopior vi fått vid realtids-PCR?

Answer 15

• SYBR Green I
• TacMan

Finns fler

Question 16

Hur fungerar realtids-PCR-systemet DNA-bindande fluorofor (SYBR Green I)?

Answer 16

• DNA-bindande fluorofor (SYBR Green I) – ett färgämne som används för infärgning, binder till dubbelsträngat DNA, absorberar blått ljus och sänder ut grönt när det är bundet. När komplexet är inbundet kan man mäta detta i detektor

Question 17

Hur kan man säkerställa att färgämnet i metoden SYBR Green I bundit rätt DNA osv?

Answer 17

Smältkurvsanalys

• Smältkurvsanalys – CYBR Gren har bundit efter 40 cykler till dsDNA, nu hettar vi upp de bildade PCR-produkterna vilket gör att CYBR Green lossnar och fluoroscensen minskar som ses på bilden. Allt dubbelsträngat kommer försvinna om vi höjer temp, kolla på mitten av bilden (där har hälften av dsDNA separerats (kolla till höger (toppen utgör mitten av den andra bilden), sammansättning och längd gör att smälttemperaturen blir annorlunda för de PCR-produkter som är ospecifika
  
  • Jämförs med positiv kontroll

Question 18

Olika realtids-PCR-system

• Hur fungerar Tacman?

Answer 18

• Enkelsträngat DNA och primer och ytterligare primer (kallas för probe)
• På proben finns Reporter som avger fluoroscense hela tiden (quensern absorberar dock detta ljus när den är i närheten
• Men när polymeras sätter sig på primer så träffar den på probe och klyver reportern som friläggs i soppan och quensern likaså så de hamnar långt ifrån varandra, nu kommer vi kunna detektera ljuset och vi har alltså en PCR-produkt som bildats

Question 19

Vad skillnaden på Taqman och SYBR Green 1 gällande diagnosticering av ex hepatit?

Answer 19

• Tacman kan fastställa HBV eller HCV
• SYBR Green 1 bara kan fastställa att det rör sig om hepatit

Question 20

Varför är Tacman mer känslig vid mutationer?

Answer 20

• Eftersom den ska fästa vid tre platser (två primers samt probe)
  
  • Viktigt att hålla sig uppdaterad om mutationer, designa om probe och primers isf

Question 21

Nämn en fördel och en nackdel för vardera Tacman och SYBR Greene1

Answer 21