Gentech

Question 1

Was umfasst die Gentechnologie?

Answer 1

Alle Methoden mit denen man DNA oder RNA analysiert, verändert oder nutzt, um biologische Prozesse zu verstehen, Krankheiten zu diagnostizieren oder therapieren

Question 2

Gentechnologische Diagnostik

Answer 2

PCR, Taq-Man, Microarrays, Sequenzierung

Question 3

Gentechnologische Forschung

Answer 3

GWAS, Rna Sequenzierung

Question 4

Gentechnologische Therapie

Answer 4

Gentherapie, CRISPR, RNA-basierte Therapie

Question 5

Wofür werden DNA Technologien eingesetzt?

Answer 5

• genetische Mutationen
• krankheitsauslösende Erreger
• Genexpressionsmuster
  identifizieren, vergleichen, ändern

Question 6

Nachweis bekannter genetischer Varianten

Answer 6

PCR / TaqMan-PCR

Question 7

Analyse vieler bekannter Varianten gleichzeitig

Answer 7

Microarrays

Question 8

Suche nach unbekannten Mutationen

Answer 8

DNA Sequenzierung (Illumina)

Question 9

Worauf basiert PCR?

Answer 9

DNA Replikation und dient gezielter Amplifikation einer bekannten DNA Sequenz

Question 10

Voraussetzungen PCR

Answer 10

• DNA Vorlage (Zielsequenz)
• zwei Primer (definieren Start und Ende)
• DNA Polymerase
• dNTPs (Basen mit Phosphorückgrad)

Question 11

Zyklus PCR

Answer 11

1. Denaturierung (Trennung der Stränge)
2. Annealing: Primer binden komplementär an Zielstellen
3. Elongation: DNA Synthese

Question 12

TaqMan PCR

Answer 12

Real Time PCR

Ziel TaqMan:
- gleichzeitige Amplifikation und Nachweis einer spezifischen DNA Sequenz in Echtzeit

• zusätzlich zur normalen PCR:
  fluoreszenzmarkierte TaqMan Primer mit Fluorophor, Quencher

4 Primer anstatt 2 wie bei normaler PCR

Question 13

Mechanismus Taq Man

Answer 13

• Gen wird amplifiziert
• Primer A für eine genetische Variante, Primer B für die andere
• Jeder Primer verschiedenfarbige Fluoreszenzmarkierer und Quencher Molekül (löscht Leuchten)
• Entweder Primer A oder B bindet je nach gen. variante vorhanden
• Fluorophor löst sich von Quencher und leuchtet farbig

Question 14

Anwendungsbereich TaqMan

Answer 14

• Genotypisierung einzelner SNPs (Sichelzellanämie)
• Erregernachweis (HIV) (man schaut ob Virus Genom im Blut vorhanden ist)
• Quantifizierung (Intensität des fluoreszenzsignals steigt exponentionell –> Erregermenge kann berechnet werden)

Question 15

Grundprinzip Microarrays

Answer 15

• Hybridisierung komplementärer Basen:
  Probe (DNA) wird fluoreszent markiert
  Komplementäre Basenpaarung bildet Lichtsignal

Signalstärke = Bindungsstärke

Question 16

Genotypisierung Microarrays

Answer 16

Bestimmung von SNPs im gesamten Genom, bildet die Grundlage für GWAS

Question 17

GWAS (Genotyp durch Microarrays bestimmen)

Answer 17

Genomweite Assoziationsstudient

Vergleich von Patienten vs Kontrollgruppe

Millionen von SNPs gleichzeitig

Identifikation krankheitsassoziierter Regionen

–> sagt nicht welches Gen die Ursache ist, sondern wo man suchen sollte

Question 18

Genexpression durch Microarray bestimmen

Answer 18

Genexpressions Microarray
- Vergleich mRNA Profile

detektiert durch:
mRNA -> komplementärDNA –> Fluoreszenzmarkierung

Farbcode:
- rot: nur Tumorzellen
- grün: nur gesunde Zellen
- gelb: beide gleich
- schwarz: nicht exprimiert

–> Tumorklassifikation, Personalisierte Krebstherapie

Question 19

Illumina Sequenzierung Prinzip

Answer 19

Illumina-Sequenzierung liest DNA, indem bei jeder Basen ein fluoreszierend markiertes Nukleotid eingebaut und detektiert wird.

Question 20

Illumina Sequenzierung Vorbereitung

Answer 20

• Genom wird zufällig fragmentiert
• DNA wird auf Chip fixiert
• 2 Adapter hinzugegeben:
  1 Flowcell (komplementäre fixierung DNA
  2. Primer adapter, damit komplementär Primer binden können
• Clusterbildung durch PCR (Signalverstärkung)
• DNA Stränge getrennt
• Komplementäre Nukleotide werden verknüpft
• Ungebundene Nukleotide werden abgewaschen
• Fotografieren von Fluoreszenzsignal

Question 21

Illumina Sequenzierung (Sequencing by Synthesis)

Answer 21

Zugabe aller vier dNTPs, jeweils:
-fluoreszenzmarkiert
-mit reversibler Terminator-Gruppe

Pro Zyklus wird genau ein Nukleotid eingebaut

Kamera erfasst die Farbe jedes Clusters → identifiziert die Base

Question 22

Geneediting

Answer 22

Mutationen korrigieren

Question 23

Gentherapie Prinzip

Answer 23

Gezieltes Einbringen / Verändern genetischer Informationen in Zellen

(krankheiten auf molekularer Ebene behandeln)

Question 24

Versch. Gentherapien

Answer 24

• Defekte Gene ersetzen (Genaddition)
• Funktionslose Gene korrigieren (Geneditierung)
• Krankmachende Gene ausschalten (Genesilencing)

Question 25

Wieso ist Gentherapie möglich?

Answer 25

Weil alle Zellen eines Menschen das gleiche Genom besitzen --> bringt man ein funktionierendes Gen in eine betroffene Zelle, kann dieses Gen dort ein funktionelles Protein herstellen, das den Defekt ausgleicht

Question 26

Wie bringt man die DNA / Gene in Zellen

Answer 26

DNA kann Zellmembran nicht spontan durchdringen --> man braucht Transportmechanismus oder physikalische Methoden

Question 27

Virale Vektoren Transport Methode

Answer 27

--> man kann Viren als DNA Transport Maschinen verwenden --> man entfernt krankmachende Gene und ersetzt sie durch TherapieGen -->infiszieren Zellen und bringen Erbgut hinein

Question 28

Verschiedene Virale Vektoren

Answer 28

es gibt RNA Viren, DNA Viren, beide haben Vorteile, aber Nachteile von RNA kann sein, dass sie sich integriet

Question 29

Nicht-Virale Transportmethoden

Answer 29

Elektroporation (kurzer elektrischer Impuls --> kurzzeitig durchlässige Zellmembran --> DNA gelangt hinein) Mikroinjektion (DNA direkt in Zellen) Lipofektion (DNA in Liposome verpackt, fusionieren mit Zellmembran)

Question 30

Transgen

Answer 30

Zusätzlich eingeführtes Fremd-Gen, dass neben usrpünglichem Genom in Zelle exisitert

Question 31

In Vivo Theapie

Answer 31

Gen oder Editiermaschinerie direkt in Körper gebracht

Question 32

Ex Vivo Therapie

Answer 32

Zellen werden ausserhalb des Körpers genetisch verändert und danach wieder eingesetzt

Question 33

Risiken und Herausforderungen Gentherapien

Answer 33

- Insertionale Mutagenes (Integration des Gens an falscher Stelle --> Tumorsuppressoren zerstören) - Immunreaktion (Körper erkennt Virus oder Protein als fremd) - Überexpression von etwas - Empisomale vektoren können verloren gehen bei Langzeitwirkung

Question 34

CRISPR Cas

Answer 34

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas: CRISPR associated Protein

Question 35

Crispr Prinzip

Answer 35

Ursprünglich war CRISPR bakterielles Immunsystem, das fremde DNA erkennt und zerschneidet --> in Gentherapie dient als präzise Genschere

Question 36

Mechanismus CRISPR

Answer 36

Erkennung: gRNA bindet komplementäre Base Bindung an PAM: (DNA Sequenz) Cas 9 prüft ob neben Zielsequenz PAM vorhanden ist, sonst kein Schnitt Doppelstrangbruch: Cas9 schneidet beide DNA Stränge genau 3 Basen vom PAM DNA Reparatursysteme weren aktiviert: NHEJ und HDR (präzise schwierig)

Question 37

Medizinische Anwendungen CRISPR

Answer 37

Sichelzellanämie: Austausch von Mutationen (Basentausch) Krebs-Immuntherapie: Deaktivierung von Checkpoint Genen in T-Zellen

Question 38

Herausforderungen CRISPR Cas Erbkrankheit Therapien

Answer 38

- Off-target Effekte (schnitte an ähnlichen aber falschen Stellen) - Doppelstrangbrüche - Verteilung im Körper

Question 39

RNA Basierte Technologien Prinzip

Answer 39

RNA Therapien nutzen RNA Moleküle direkt als Wirkstoff oder Regulator --> greifen nicht direkt in DNA ein --> Veränderungen sind reversibel

Question 40

Antisens RNA

Answer 40

- komplementäre RNA bindet an fehlerhafte Ziel mRNA --> blockiert Translation doer Splicing

Question 41

mRNA Impfung

Answer 41

mRNA wird in Lipid-Nanopartikeln verpackt gelagnt in Zytoplasma, wo Ribosomen übersetzen, Antigen, Immunantwort

Question 42

Herausforderungen moderne Gentherapie

Answer 42

Effizienz (nur Bruchteil Zielzellen) Immunantwort (Abwehrreaktion) Sicherheitsrisiken (zufällige Integration oder Off Targets)