Amplificação do DNA durante a PCR
- A DNA polimerase vai perdendo a eficiência ao longo da PCR;
- TODA VEZ que um nucleotídeo é incorporado à nova molécula que ta sendo formada, ocorre liberação íon H+ e Pirofosfato;
- Com o tempo as condições para que a PCR ocorra, vão sendo desfavoráveis;
Análise QuaLItativa
- Fase de platô só interessa o produto final. Se o alvo amplificou ou não;
- Gerou fluorescência? Sim ou Não?
Aplicações da Análise QuaLItativa
- Detecção de patógenos;
- Genotipagem;
- Detecção de mutações;
- Identificação de espécies;
Análise QuanTItativa
- Me interessa saber quanto se tinha do meu alvo antes da amplificação acontecer;
- Analisa-se a fase exponencial da PCR;
Aplicações da Análise QuanTItativa
- Análise de expressão gênica;
- Quantificação de Carga viral;
- Quantificação de microRNA;
Quantificação Absoluta
É realizada uma quantificação absoluta para determinar a concentração de ácidos nucleicos nas amostras. Isso pode ser feito usando espectrofotometria, fluorimetria ou técnicas similares.
A amostra laranja tem 10000 cópias, quanto que eu vou ter da amostra azul?
Cada vez que a faixa muda, eles dobram. Sendo a azul duas mil cópias.
E da amostra vermelha?
Quatro mil cópias.
Quantificação Relativa
É calculada usando uma fórmula que leva em consideração os valores de Ct do gene alvo e do gene de referência. Isso permite comparar a expressão do gene alvo em diferentes condições experimentais, usando a expressão do gene de referência como base de comparação.
