Varför gör man PCR?
För att bilda mer av en specifik DNA-sekvens
Används i t.ex. faderskapstest och brottsplatsutredningar
- då letar man t.ex. efter Alu-element som är en specifik transposom
Vad behövs för att kunna köra en PRC?
- Templat
- dNTPs (byggstenar)
- DNA polymeras Taq (termofil)
- Primrar
Vilka är PCRs tre steg?
- Denaturering i 95 grader i 1 min
- Hybridisering i 55 grader i 1 min
- primrarna binder in till specifika bassekvenser - Elongering i 72 grader i 1 min
- DNA polymeras Taq
Körs många gånger
Varför gör man en elektrofores?
För att separerar laddade molekyler med avseende på storlek
T.ex. separera DNA sekv - som är negativt laddade. Vandrar mot +pol
Små molekyler vandrar snabbast genom gelen
Hur går elektrofores till?
Molekyler laddas på gelen och en spänning sätts över gelen.
Negativt laddade molekyler vandrar då mot +pol
Små molekyler vandrar snabbare pga mindre motstånd.
Gelen består av Agar och ofta märks DNA/molekyler med floureserande ämne
När kör man Sekvensering?
När man vill veta en DNA-sekvens uppbyggnad - vilka nukleotidersom ingår.
Hur går sekvensering till?
Man kör en PCR men tillsätter också några ddNTPs - när ddNTP används av DNA-pol kommer elongeringen att avbrytas. På detta sätt får man olika långa sekvenser
Man tillsätter t.ex. dATP, dTTP, dCTP och dGTP
+ ddGTP
Då kommer ddGTP ibland att binda in som en komplementär bas till dCTP - på de ställen där dGTP vanligtvis binder in
- man får på så sätt olika långa sekvenser som alla avslutas med ett ddGTP och kan se var alla G (C) är i DNA sekvensen
- gör detta med alla olika baser
Hur fungerar Microarray?
Massor av små brunnar som innehåller probe (en komplementär DNA-sekv)
Tillsätter provet av mRNA som har gjorts om till cDNA. Infärgat med fluoroscens
De cDNA som hybridiserar med proben kommer att ge fluorecens-signal som röd/grön
Ger båda proven utslag så blir det gult
Vad är QPCR?
Man tar en frisk och en sjuk cell
Renar fram RNA —>cDNA
Kör en PCR med primer som passar för den gen som vill undersökas - märker in med fuorecens
Efter nya cykler - Ser hur mkt DNA som bilas per cell
Hur går kloning till (bakterie)?
- Restriktionsenzym klipper ut en DNA-dit (specifikt enzym för specifik gen)
- Samma restriktionsenzym klipper även upp plasmiden
- Genen ligeras in i plasmid
- Plasmiden sätts in i bakterien
- Bakterien förökar sig och bildar fler kopior
