1
Q
Que sont les plasmides?
A
- ADN extrachromosomique, autoréplicatif
- Molécules circulaires (exceptions linéaires)
- Présents dans tous les genres bactériens/archaebactériens
- Taille : 1-2 kb à 10^3 kb (variations)
2
Q
Les plasmides codent pour des fonctions accessoires, c’est-à-dire pas essentielles au fonctionnement fondamental de la cellule. Exceptions?
A
- Rhizobium
- Porte gènes codant pour ARNt de l’arginine et les gènes minCDE sur un plasmide → gènes essentiels de traduction - Vibrio cholerae (2 chromosomes)
- Possède un mégaplasmide avec gènes parAB et thrS → gènes impliqués dans le partage des chromosomes
3
Q
Comment les grands plasmides sont-ils différents des chromosomes?
A
Au niveau de l’origine de réplication
- Plasmides = OriV
- Chromosomes = OriC
Au niveau des protéines responsables de l’initiation de la réplication
- Plasmides = repABC
- Chromosomes = dnaA
4
Q
Nomenclature des premiers plasmides?
A
En fonction des phénotypes
- R = abiorésistance
- F = fertilité (conjugaison)
- Col = colicine
- Tol = catabolisme du toluène
- Ti = tumor initiation/inducing
5
Q
Nomenclature des plasmides (maintenant)?
A
p + initiales des auteurs + nombres
6
Q
Protéines encodées sur les plasmides?
A
- quelques unes à 10^2 protéines/plasmide
- Protéines accessoires
- Confèrent avantage sélectif : Abior, catabolismes de sources de carbone rares, facteur de virulences…
- Fonctions cryptiques (fonctions inconnues)
7
Q
Pourquoi y-a-t’il des gènes sur des plasmides au lieu de les mettre sur le chromosome?
A
- Plasmides se répliquent rapidement
- Distribution inégale des plasmides dans les souches bactériennes : confère avantages locaux en ↑ niche écologique (adaptation/spécialisation), Donc si changements soudains, certaines souches vont survivre
- Plasmide = génome accessoire → modification de la répartition des souches = échanges horizontaux facilités
8
Q
Réplication des plasmides?
A
- Réplication autonome = se nomme réplicon (ex de réplicons : chromosome, plasmides, phages)
- OriV = origine de réplication végétative
- OriT = origine de réplication de transfert (conjugaison)
- Les protéines initiant la réplication sont d’origine plasmidique, mais la poursuite de la réplication se produit en empruntant les protéines de la cellule hôte
9
Q
Les deux mécanismes de réplication des plasmides circulaires?
A
- Réplicaction thêta
- Cercle roulant
10
Q
Réplication thêta unidirectionnelle des plasmides?
A
- Ouverture des deux brins d’ADN
- 1 fourche de réplication fait le tour
- Terminaison et résolution près de l’OriV
- Les deux plasmides se séparent
11
Q
Réplication thêta bidirectionnelle des plasmides?
A
- Ouverture des deux brins d’ADN
- 2 fourche de réplication qui font 1/2 tour
- Terminaison et résolution à l’extrémité de l’oriV : réplication se termine quand les deux fourches se rencontrent
- Les deux plasmides se séparent
12
Q
Réplication thêta des plasmides : caractéristique?
A
Réplication la plus fréquente chez les gram -
- pCol, pR, pF
- Chromosme
13
Q
Réplication en cercle roulant : caractéristiques?
A
- Très répandue
- Gram +, Gram -, archaea
- Initiée par la protéine Rep (origine plasmidique)
- Mécanisme similaire à la conjugaison
- Réplication en 2 étapes, 2 origines de réplication
14
Q
Décrit le mécanisme complet de la réplication en cercle roulant des plasmides.
A
- Un dimère de la protéine Rep reconnaît l’origine de réplication DSO (sur ADN:2) via les séquences palindromiques de DSO → forme ADN cruciforme
- Rep agit comme une endonucléase et effectue une coupure simple brin au site DSO : rep s’y attache en 5’ via résidu tyrosine
- L’extrémité 3’-OH de DSO sert d’amorce pour l’ADNpol III (hôte) = réplication par déplacement de brin (synthétise le brin en détachant la molécule d’ADN:2)
* Réplication terminée = ADN:2 + ADN:1-Rep - Rep recircularise l’ADN:1 en transférant 5’-P au 3’-OH (réaction de phosphotransférase, pas d’ATP)
- Origine de réplication SSO sur ADN:1 permet la reconnaissance par l’ARNpol pour la synthèse de la première amorce d’ARN pour l’ADNpol III = synthèse
- Génération de deux plasmides bicaténaires
15
Q
Lors de la réplication en cercle roulant des plasmides, que se passe-t-il avec Rep suite à la circularisation de la molécule d’ADN simple brin?
A
Rep est une protéine d’initiation de la réplication. Lorsque l’initiation est terminée, elle est dégradée (elle sert juste 1x)
** La concentration de rep est proportionnelle au PCN (car c’est elle qui initie la réplication)
16
Q
Réplication en cercle roulant des plasmides : dans quel contexte peut-t-il y a voir une accumulation d’ADN:1?
A
Si l’ARN pol fonctionne moins bien et ne reconnaît pas l’origine de réplication SSO pour synthétiser la première amorce d’ARN = accumulation de l’intermédiaire de réplication
17
Q
Pourquoi la réplication des plasmides (chromosomes) linéaires est-elle différente (difficile)?
A
Extrémités linéaires sont difficiles à partir du moment ou l’ARN pol synthétise le dernier fragment d’Okazaki et que la dernière amorce d’ARN est enlevée
- Les ADNpol ne peuvent pas initier la réplication : elles peuvent seulement allonger une amorce qui est déjà là
- Les cellules procaryotes n’ont pas de télomérases comme les eucaryotes → il faut donc d’autres stratégies pour éviter la perte d’information génétique aux extrémité (car pas de synthèse d’ADN)
- Important que la ¢ puisse distinguer les extrémités linéaires des plasmides/chromosomes des coupures double brins (dommages)
18
Q
Stratégie de Streptomyces pour la réplication du chromosome bactérien linéaire?
A
- Réplication commence à l’Ori (grâce à DnaA) au centre du chromosome; réplication est bidirectionnelle
- Streptomyces possèdent des séquences inversées répétées aux extrémités et une protéine terminale en 5’ → process = “patching”
- Le chromosome linéaire se réplique, mais l’extrémité 3’ n’est pas synthétisé et reste sous forme simple brin (pas d’amorce)
- 3’ simple brin permet la formation d’un complexe entre les séquences inversées répétées et la protéine terminale en 5’
- Complexe est capable de former une amorce qui peut être allonger par des ADN pol de la cellule hôte = pas de perte d’information
19
Q
Stratégie de Borrelia pour la réplication du chromosome bactérien linéaire?
A
- Extrémités du chromosome sont en “hairpin”
- Réplication commence au centre (à l’ori) et les fourches se rendent jusqu’au “hairpin”, ce qui forme un chromosome dimère (contient 2 copies)
- ResT permet la résolution du dimère en coupant le dimère et en recréant les hairpin pour séparer les deux copies
20
Q
Chez quelles espèces retrouve-t-on des plasmides linéaires?
A
Borrelia, Streptomyces, Agrobacterium, Rhodococcus fascians…
21
Q
Fonction de la région Ori (v) sur les plasmides?
A
- Région restreinte contenant des gènes/séquences responsables de la réplication
- Si on conserve l’ori d’un plasmide, on conserve les propriétés du plasmide (génétique moléculaire : vecteurs). Ex : AbioR
22
Q
Spectre d’hôte des plasmides, exemples?
A
Se définit comme le nombre d’espèces dans laquelle le plasmide peut se répliquer de façon autonome
- Spectre restreint : ex= pColE1(entérobactéries seulement : E. coli, Klebsiella, Salmonella)
- Spectre large : pRK2 → plupart des gram -, pRSF1010 → plupart des gram +
23
Q
Quels gènes sont responsables du fait qu’un plasmide a un spectre large?
A
Les gènes Rep (initiation réplication)
- Plasmides à large spectre : leurs promoteurs et rbs (site d’attachement ribosome) des gènes d’initiation sont polyvalents = reconnus par plusieurs ARNpol = expression/traduction dans ++ hôtes
*Rôles dans les échanges horizontaux de gènes
24
Q
Les plasmides à large spectre sont souvent retrouvés chez les Gram __?
A
Gram +
25
Vrai ou faux : les plasmides Gram + qui ont une réplication non fonctionnelle dans les Gram + sont des plasmides de Gram -
Vrai, le contraire est aussi vrai.
En raison de la divergence évolutive des promoteurs et rbs
26
Comment peut-t-on déterminer le spectre d'hôte d'un plasmide?
- Demande temps et énergie
- Transfert in vitro inter-espèces par transformation/conjugaison
- pas possible avec plasmides cryptiques, il faut un plasmide avec un phénotype (ex : AbioR), ce qui permet de savoir la molécule d'ADN se réplique dans une espèce
27
Qu'est-ce que l'incompatibilité plasmidique?
Co-existence stable de plusieurs plasmides avec différentes Ori dans la même cellule (en nature = ++ plasmides/cellule = groupes d'incompatibilité différents)
28
Que se passe-t-il si on retrouve des plasmides du même groupe d'Inc dans la même cellule?
Interférence au niveau de l'ori
- Contrôle croisé de réplication
- Interférence de partage (partage est critique pour les plasmides avec faible PCN)
- élimination du plasmide
29
Comment peut-on déterminer les groupe Inc de plusieurs plasmides? Savoir s'ils sont dans le même groupe
Insertion de caractères phénotypes (AbioR) = sélection
- Mettre 2 plasmides dans la même cellule et comparer les croissance en absence/présence d'AbioR
- Ensuite, comparer les fréquences de conservation des AbioR
- Si fréquence de conservation en présence de l'autre plasmide est plus petite que la fréquence de conservation seule = même groupe d'Inc
30
Comment peut-on maintenir dans la même cellule deux plasmides du même groupe Inc (pour études)?
- Agents de sélection différents sur chaque plasmide = maintient de la pression sélective
- Si cellule élimine le plasmide, elle meurt → elle n'a pas le choix de garder les deux
Applications : interaction entre des produits de gènes sur plasmides différents
31
Pourquoi les plasmides régulent-ils leur nombre de copies dans une cellule?
Il faut une gamme restreinte du PCN, sinon surcharge métabolique de la cellule. La réplication et l'expression des gènes accessoires demandent beaucoup d'énergie, ce qui est un désavantage en condition non-sélective.
32
Comment nomme-t-on les plasmides à haut nbr de copies? À faible nbr de copies?
- Plasmides Relax
- Plasmides Stricts
33
Contrôle de la réplication chez les plasmides?
- Concentré autour de l'oriV
- Contrôle module l'initiation de la réplication
34
Mécanisme de contrôle de la réplication dans le plasmide pColE1?
Création d'ARN:2
- Mécanisme d'initiation de la réplication sans la protéine Rep : interférence ARN-ARN
- ARNII = amorce pour la réplication = site de régulation
- ARNI = complémentaire à ARNII car encodée dans la même région sur le brinC, interfère avec l'activité de l'ARNII
- ARNI inhibe la réplication en formant un ARN:2 avec l'ARNII qui n'est plus disponible comme amorce (pas d'hybridation ARN-ADN à l'oriV qui est reconnu par RNase H normalement)
35
pColE1 a les mêmes caractéristiques conservées que d'autres plasmides, comme...?
pBR322, pUC, pBAD, pET → l'oriV est la même!
36
Étapes du mécanisme de contrôle de la réplication dans le plasmide pColE1? Appariement ARNI-ARNII
1. Kissing complex : interaction ARNI-ARNII est instable
2. Intervention de Rop pour la stabilisation du complexe = hug complex
3. Mène à l'inhibition d'appariement ARNII-ADN, pas de dégradation de l'ARNII par la RNaseH pour faire l'amorce
4. Inhibition de la réplication
37
Mécanisme de contrôle de la réplication dans le plasmide pColE1 : rôle de Rop?
Stabilisation du kissing complex pour former le hug complex
- Son rôle serait accessoire, car Rop muté augmente moyennement le nombre de copies de plasmide (cela n'empêche pas la réplication tant que ça de ne pas avoir rop)
38
Pourquoi la concentration d'ARNI dans pColE1 est proportionnel au nombre de copies de plasmide dans la cellule?
Car ARNI est synthétisé à partir du plasmide, donc la concentration d'ARNI dépend du nombre de copies.
39
pColE1 : l'inhibition de la réplication est presque complète à combien de copies/cellule?
16
40
Explique comment la concentration d'ARNI dicte l'inhibition de la réplication du plasmide pColE1.
En fonction de la force des promoteurs dans la région où sont codés ARNI et ARNII
- Promoteur ARNII est plus fort que celui de l'ARNI = plus forte complémentarité avec l'ARNpol
- Complexe de transcription est gros : on peut pas transcrire les 2 brins en même temps car encombrement stérique. Ceci assure que ARNII est tjrs transcrit en premier
- Plus PCN ↑, plus promoteur ARNI devient fort et transcrit ARNI qui inhibe la réplication = contrôle
41
Quels sont les impacts d'une mutation dans ARNI dans le plasmide pColE1?
ARNI et ARNII sont codés dans la même région sur des brins complémentaires : mutation de 1 nt dans l'ARNI mute obligatoirement 1 nt de l'ARNII = appariements inchangés (même interférence de l'ARNI)
- Par contre, l'ARNI muté n'est plus complémentaire avec l'ARNII original = plasmides compatibles (plus dans le même groupe Inc)
42
Contrôle de la réplication chez les plasmides pR1 et pColIb-P9?
Régulation de traduction de RepA par un ARN anti-sens (interférence)
43
Plasmide pR1 : contrôle de la réplication?
Utilisation d'un petit ARNc qui se lie à l'ARNm codant pour RepA afin de réguler son PCN
1. RepA = transcrite (promoteur ++ fort), synthèse de repA jusqu'à atteindre PCN max
2. PCN max = CopB est produite (promoteur - fort) = réprime PrepA
3. Après, copA génère ARN anti-sens qui s'apparie avec ARNm de repA = ARN:2 = dégradé par RNase (copA n'altère pas copB)
** On veut arrêter la transcription de RepA ET dégradé les copies de RepA déjà présentes car on veut diminuer la réplication (PCN critique)
44
pR1 : si PCN ↑, que se passe-t-il avec copA, repA?
La concentration de copA ↑, concentration de repA ↓= absence de réplication et maintient du PCN
45
Plasmide pColIb-P9 : contrôle de la réplication?
Couplage traductionnel RepY-RepZ
1. Traduction de RepY permet d'ouvrir la structure secondaire (tige-boucle) d'ARN qui bloque la séquence Shine-Dalgarno de RepZ = traduction RepZ possible = initiation de la réplication
2. Contrôle avec ARN anti-sens (produit quand PCN ↑ ++) : s'apparie au rbs de RepY et le bloque = repZ pas traduit = pas de réplication
*ARN anti-sens modifie structure 5' de l'ARNm de RepY
46
Plasmide pColIb-P9 : la concentration de l'ARN anti-sens inc est proportionnelle à quoi?
À Pinc (promoteur) et au nombre de copies de plasmides → PCN qui ↑ "priorise" le promoteur
Si la concentration de inc ↓ = ARNrepYZ est synthétisée = ↑ PCN
47
Plasmide pT181 : mécanisme de contrôle de la réplication des plasmides?
Mécanisme d'atténuation de RepC (protéine initiation) avec un ARNI interférent qui induit la terminaison de la transcription en amont de RepC
- ARN interférent se lie à l'ARNm de RepC → ARN:2 empêche la formation d'une structure secondaire de l'ARNm = pas de transcription (STOP) = RepC pas transcrit → ↓ réplication
48
Exemples de plasmides à itérons? C'est quoi un plasmide à itérons?
- pSC101 et pF
- Plasmides qui comportent des itérons dans la région oriV (3-7 répétitions de 22 pb) → repA interagit avec les itérons R1, R2 et R3 pour l'initiation de la réplication
49
Plasmides à itérons : contrôle de la réplication chez les plasmides?
2 mécanismes superposés
1. Régulation de la concentration de RepA → autorégulation transcriptionnelle, RepA inhibe sa propre transcription en se liant à son propre promoteur (plus concentration de RepA ↑, plus la transcription de RepA ↓)
2. Hypothèse de couplage/menottes : quand la concentration de RepA devient critique, formation de dimères de RepA qui se lie sur les plasmides adjacents via les itérons → interaction inhibe la réplication des plasmides car machinerie de réplication a pas accès (blocage physique) = ↓ PCN
50
Expérience qui a permis de confirmer le modèle du contrôle de la réplication des plasmides à itérons avec dimérisation de RepA?
1. Mettre protéine RepA sur un plasmide trans qui n'a pas besoin de RepA pour initier sa réplication
2. Mettre ce plasmide en contact avec un plasmide qui lui a besoin de RepA pour se répliquer
→ Même si le plasmide trans a pas besoin de repA, sa protéine repA dimérise avec RepA de l'autre plasmide = pas ↑ du PCN : montre que dimérisation peut se faire entre des plasmides différents s'ils portent des itérons
50
Expérience qui a permis de confirmer le modèle du contrôle de la réplication des plasmides à itérons avec dimérisation de RepA?
1. Mettre protéine RepA sur un plasmide trans qui n'a pas besoin de RepA pour initier sa réplication
2. Mettre ce plasmide en contact avec un plasmide qui lui a besoin de RepA pour se répliquer
→ Même si le plasmide trans a pas besoin de repA, sa protéine repA dimérise avec RepA de l'autre plasmide = pas ↑ du PCN : montre que dimérisation peut se faire entre des plasmides différents s'ils portent des itérons
51
Plasmides à itérons : expérience si mutants de repA?
Empêcher RepA de dimériser sans modifier l'initiation de la réplication → mène à une ↑ du PCN (mutation au pôle sud de repA, partie qui se lie à l'autre repA)
52
Contrôle de la réplication des plasmides : interactions des plasmides avec des protéines de l'hôte?
Avec DnaA
- Interactions Rep-DnaA = initiation de la réplication (rep de plasmides à larges spectres = interaction efficace avec les DnaA de différentes espèces)
Avec méthylase Dam
- Sites de méthylation à l'oriV
- Hémi-méthylation des brins permet contrôle de la réplication (séquestration et retard) → il faut une méthylation complète pour la réplication
53
Comment se produit la formation de multimères chez les plasmides?
Problème de terminaison lors de la recombinaison en cercle roulant → multimères = plasmides perdus pendant la divison cellulaire (2 copies sur le même plasmide)
54
Mécanismes de résolution de dimères chez les plasmides?
1. Recombinaison site-spécifique encodée par un plasmide
- Phage P1 → prophage = plasmide
- Recombinase Cre reconnaît si + que 2 sites loxP sur le même plasmide = recombinaison
2. Recombinaison site-spécifique encodée par l'hôte
- Utilisation de recombinase XerC/D de l'hôte
- Recombinase reconnaît si + qu'un site cer (pColE1) ou site psi (pSC101) sur le plasmide = recombinaison
55
Rôle des protéines accessoires dans la résolution de multimères des plasmides?
Facilitent la recombinaison, indépendants de FtsK
- ArgR + PepA (hôte)
56
Comment se fait le partage des plasmides pR1?
parC, ParR et ParM
1. parC double avec réplication → ParR s'y fixe et forme un complexe qui est reconnu par ParM
2. Liaison ParM-complexe = signal polymérisation de ParM au centre de la ¢ vers les extrémités
3. Polymérisation du filament pousse les plasmides aux pôles pour le partage (filament stable quand ParM-ATP est lié à parC-ParR)
4. ParM-ADP = dépolymérisation complète du filament = plasmides aux pôles
57
Partage des plasmides pR1 : les filaments de ParM sont apparentés à ?
L'actine chez les eucaryotes
58
Comment se fait le partage des plasmides pP1 et F?
ParA, ParB et parS
1. ParA se lie aléatoirement sur le nucléoide de la cellule (ParA-ATP)
2. ParB forme un complexe avec parS (sur plasmide), qui se lie à ParA sur le nucléoide → liaison inactive ParA (ParA-ADP) = ParA ne peut plus lier nucléoide = bye
3. Vagues d'association ParA-complexe font "avancer" le plasmide sur le nucléoide par traction séquentielle (petits sauts)
59
Différences entre ParM et ParA (partage des plasmides)?
- ParM : sur pR1, apparenté à l'actine. Longs filaments
- ParA : sur pP1 et F, pas apparenté à l'actine mais à MinD, filaments plus courts que ParM
60
Plasmides : incompatibilité liée au partage?
Peut se produire quand 2 plasmides ont le même système de partage dans la même cellule = partage mixte = élimination d'un des plasmides dans les ¢ filles
** Souvent un mix avec systèmes de réplication similaires
61
Que sont les plasmides satellites?
- Plasmides avec délétions dans les fonctions accessoires + gènes Rep (mais conservation de l'Ori) = ↓ coût métabolique
- Parasites moléculaires (pas des plasmides) qui permettent le maintient d'un répertoire de gènes accessoires = populations hétérogènes de plasmides intracellule
- Dépendent des Rep des plasmides complets de la même famille dans même ¢ → protéines Rep interagissent à l'OriV des plasmides satellites
Génétique bactérienne
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