1
Q
Struktur RNA-Polymerase
A
- Kern RNAP besteht aus
- zwei alpha-UE
- ein beta UE
- manchmal auch omega UE (Elongationsform)
- RNA-Holoenzym –> Initiationsform der RNAP
- Sigma-UE
- bindet an Promotor
2
Q
Promotor
A
- Promotor Bindestelle für RNA-Polymerase
- Haben typische Nukleotidsequenz
- Wird von RNAP erkannt
- -35 und -10 Region (Pribnow Box) mit spacer von ca. 17 bp
- Core RNAP besteht aus 2 slpha UE, 1 beta UE
- Holo-RNAP aus core + sigma UE
- Sigma UE
- Vegetative sigma UE
- Essentiell, braucht Promotor
3
Q
Funktion der RNA-Polymerase
A
- Initiation
- Binden RNAP an Promotor
- DNA trennt sich in 2 Stränge am zentralleen Teil der Promotorsequenz
- zwischen -12 und +5
- Elongation
- Termination
- Terminatoren
- freie RNA entsteht von RNAP
- kann unmittelbar sekundärstrukturen formen
- spezifische stem loop Strukturen gefolgt von oligo-U sind Terminatoren
- werden von RNAP erkannt
- sind Stoppsignal
- Freisetzen des Transkripts
- Terminatoren
4
Q
(!) Struktur Sigma-UE
A
5
Q
(!) Funktion Sigma-UE
A
6
Q
Regulation der Genexpression: AUstausch der Sigma-UE
A
- Gene können aktiviert und inaktiviert werden
- Große Gruppen von Gene können koordiniert hoch- oder runterreguliert werden durch Austausch der Sigma-UE von RNAP
- Meisten Bakterien haben mehrere Sigma-UE
- Unterschiedliche Sigma UE erkennen unterschiedliche Promotorsequenzen
- Konkurrieren für RNA-Kern
7
Q
Verschiedene Sigma-Faktoren in E.Coli
A
8
Q
Repression der Genexpression
A
- Erlaubt RNAP nicht zu binden
- Transkription wird vorzeitig abgebrochen
- Trennung RNP von der DNA-Vorlage
- Repression durch sterische Behinderung
- Repressor zwischen -35 und -10 Stelle
- Represso Bindestelle überlappt Kernpromotorelemente
- Blockiert Erkennung des Promotorsvon RNAP
- Repression durch Schlaufenbildung
- Repressoren binden an distalen Stellen
- Interagieren miteinander durch Shclaufenbildung
- Repression des Promotors
- RNAP kann nicht transkribieren
9
Q
Aktivierung der Genexpression
A
- Transkriptionsfaktoren aktivieren RNAP
- Binden an Sequenzspezifische DNA stellen in der Nähe des Promotors lokalisiert
- Protein-Protein Interaktionen mit RNAP und TFs und Alpha-CTD
- Alpha-UE-CTD
- Zwei Domänen im flexiblen Linkern: CTD und NTD
- Alpha-CTD kann spezifisch mit vielen Aktivatoren interagieren und mediates Kontakt mit RNAP Kern
10
Q
Klasse I Aktivierung
A
- TF interagiert mit alpha-CTD
- Aktivator stromaufwärts gebunden
- Kontakt mit alpha-CTD der RNAP
- Rekrutieren der Polymerase an Promotor
11
Q
Klasse II Aktivierung
A
- Interaktion zwischen TF mit Sigma, alpha-NTD oder Alpha-CTD
- Aktivator bindet an Ziel neben Promotor -35 Element
- Gebundener Aktivator interagiert mit Domäne 4 des Sigma70
- Um Bindung zu gewährleisten muss Aktivator an Position -41,5 bebunden sein
12
Q
Simultane und unabhängige Kontakte zweier Aktivatore
A
13
Q
bakterielle Signaltransduktion
A
Die Aktivität von Transkriptionsfaktoren muss kontrolliert werden zur Antwort auf umwelt-bedingte und Zelluläre Signale à Signaltransduktion
Kontrollmechanismen
- De-novo Expression des Regulator
- Allosterie: Bindung kleiner Moleküle zu einem Regulator-Protein (Ein-Komponenten Systeme)
- Bindung anderer Proteine, e.g. einen Antagonisten oder „Anti-Faktor“
- Chemische Modifikationen des Regulators, z.B. durch Phosphorylierung (Zwei-Komponenten-Systeme) oder Disulfid-Brücken Bildungen (oxidativer Stress)
- Proteolytische Prozessierung des Regulators
- Sequestration des Regulators (z.B. Interaktion mit Membran Proteinen
- Expoort eines Regulators
14
Q
Einkomponentensysteme
A
- Der Regulator hat eine sensorische Domäne
- Reagiert mit einem Molekül, das die Zelle betritt
15
Q
Einkomponentensysteme Beispiel: Arg Operon: Aktivierung Repressors mithilfe Corepressor
A
- Arg Operon: Gene für Arginin Biosynthese Enzyme
- Repressor wird mithilfe kleinen Corepressor aktiviert
- Repressor inhibiert Expression des arg Operons bei Anwesenheit des Corepressor Arginin
- Wenn Arginin vorhanden à Expression des arg Operons (Arginin Biosynthese Enzyme) nicht notwendig
16
Q
Einkomponentensysteme - Beipiel: lac Operon: Inaktivierung Repressors durch Inducer
A
- Lac Operon: Gene für beta Galactosidase (spaltet Lactose zu Monomere)
- Repressor im alleine Zustand aktiv
- Bindung eines Inducers an Repressor bewirkt Inaktivierung des Reprssors à Transkription fiindet statt
- Inducer ist Lactose
- Bei Anwesenheit von Lactose in Zelle wird beta-Galactoseidase benötigt
17
Q
Einkomponentensysteme: Beispiel: maltose Operon Aktivierung der Gene durch small Inducer
A
- Maltose Aktivator Protein aktiviert RNAP
- MAP bindet an Aktivator Bindestelle bei Anwesenheit des Inducers
- RNAP bindet an mal Promotor à Transkription proceeds
- Ohne Inducer keine Genexpression
18
Q
Zwei-Komponenten-Systeme
A
- Der Sensor phosphryliert das Regulator Protein
Komponenten
- Sensorkinase
- Membrandurchspannend
- Sensordomäne an der Außenseite
- Messung des Wertes der Umweltparameter (Temperatur, pH, Konzentration Substanzen)
- Wertänderung à Konformationsänderung à Kinasedomäne im Cytoplasma, His wird phosphoryliert
- Antwortregulator
- Wirkt wie Transkriptionsfaktor (Repressor oder Aktivator)
- Bindet im phosphorylierten Zustand an eine regulatorische DNA-Sequenz
- Hemmt oder initiiert Genexpression
19
Q
Unterschiede zwiscee Ein- und Zweikomponentensysteme
A
Einkomponentensystem
- Nur eine Komponente beteiligt als Transkriptionsfaktor
- Inhibierung oder Aktivierung der Genexpression, Regulation
- Vorhandensein des Signals (Molekül) INNERHALB der Zelle aktiviert/inaktivert Repressor-/Aktivator-Protein direkt
Zweikomponentensystem
- Reguliert Genexpression anhand von EXTERNEN Signalen
- Die Änderung der Umgebung anzeigen
- Zwei Komponenten
- Reaktion der Zelle angemessen auf das Signal
20
Q
Physiologische Funktionen von TS
A
TCS könen folgende Informationen erkennen (sensen)
- Nährstofflimitationen (Phosphat, Stickstoff)
- Änderungen in Osmolarität
- Redoxzustand der Atmungskette
- Kleine Moleküle, einschließlich Quorum sensor Moleküle (‚Soziomikrobiologie)
- In Pflanzen: Ethylen und Cytokinin (Entwicklungssignalmoleküle)
Antwort des TCS auf Signale
- Stressantworten und Adaptationen
- Chemotaxis
- Entwicklung
- Virulence
21
Q
Domänen der TCS
A
- Sensorkinase
- Responseregulator
22
Q
Sensorkinase
A
- Transmitterdomäne – hochkonserviert
- C-terminal
- Konservierte ATP-Bindestelle am C-Terminus
- Phosphorylierungsstelle: konserviertes His (H-Box)
- Hochspezifisch gebunden an Receiver-Domäne für Phosphattransfer
- Sensordomäne – Variabel
- N-terminal
- Oft Membraninserted
- Kann extrazelluläre Unterdomänen besitzen, ‚antennen‘
- Linker/HAMP Domäne
23
Q
Responseregulator
A
- Receiverdomäne – hochkonserviert
- Bekommt Phosphat der Transmitterdomäne
- 5 alpha-Helices und 5 beta-Stränge, alternierend (120 aa)
- Hochkonserviertes Asp (Position 54-58) und weitere hochkonservierte AS bilden saure Tasche, wo Mg++ bindet
- Katalysiert Phosphotransfer von SK zum eigenen Asp-Rest
- Konformationsänderung nach Phosphorylierung
- Outputdomäne – Variabel
- Transkriptionsfaktrenn
- Enzyme (manche produzieren second messenger)
- Proteolytische Zielfaktoren
Linker
24
Q
Turgordruck
A
- ~ 10 atm
- Osmotischer und Turgordruck wirken gegeneinander
- Zelle enthält höhere Konzentration von kleinen osmotisch aktiven Substanzen als Umgeebung
- Wasser fließt ständig in Zelle hinein à osmotischer Druck
- Turgordruck wirkt diesen entgegen, Druck des Zellsafts auf die Zellwand
25
Plasmolyse
* Der durch Osmose verursachte Wasserentzug aus einer Zelle
* Plasmamembran löst sich von Zellwand ab
* Hohe Salzkonzentrationen/Osmolaritöt im Außenmedium resultiert in Wasserefflu und Schrumpfen der Zelle à **Plasmolyse**
* Wasser diffundier aus Zelle hinaus
* Wachstum der Zeelle ist inhibiert
* Enzyme funktionieren nicht
26
Bakterielle Adaptation zu hoher Osmolarität
Die hyperosmotische StressAntwort erfolgt in 3 Phasen
1. Zustrom von K+-Ionen (\>0.5 M)
* Bioverfügbarkeit von Kalium sehr hoch
* Mehr Teilchen in Zelle à hohe Osmolarität
* Elektrische Ausbalancierung notwendig
1. Synthese von Gegenionen (Glutamat)
* Glutamat in den meisten Fällen
* Aus dem Citratzyklus (aus Ketoglutarat
* Nur kurzfristige Lösung
* Nicht kompatibel mit Stoffwechsel
2. Austausch von K+ gegen „compatible solutes/osmoprotectants“
* Können aufgenommen oder synthetisiert werden
* Glyinbetain, Prolin, Trehalose
27
Hitzeschockantwort
* Meisten Hitzeschock Gene kodieren für Chaperone und Proteasen (Topoisomerasen)
* Hitze à Denaturierung der Hydrophoben Aminosäuren außen
* Chaperone
* Binden an hydrophobe Reste außen und
* helfen bei der Rückfaltung
* Proteasen
* Bauen Proteine ab, wenn Chaperone nicht helfen können
* Bei irreversibler Denaturierung
* Topoisomerase
* Stärkere Verdrillung der DNA
* Kann somit nicht so leicht aufgelöst werden
28
Regulation von Sigma32 - Aktivierung
* Post-transriptional
* Translationale Regulation
* Sekundärstruktur von *rphH* mRNA (kodiert für Sigma-32) agiert als molekularer Thermometer
* Relativ stabil
* Wird nicht oft translatiert
* Schmilzt bei hohen Temperaturen
* Geschmolzene Sekundärstruktur von *rpoH* Mrna
* Sensor für Temperatur
* Rasanter Anstieg der Transkribierung
* Aktivierung erfolgt nicht an den Promotoren
* Bei Hitzeschock ist Sigma-32 stabilisiert (zusätzlich aktiviert)
* Indirekte Wirkung
* DnaK-Chaperonsystem
* Ebenfalls Bestandteil des Sigma32 Regulons
* Wird gefördert
* Vermehrtes Auftreten denaturierte Proteine führt zur verstärkten Bindung des Chaperon DnaK an fehlgefaltete Proteine
* Rekrutierung DnaK verlängert die Halbwertszeit von Sigma32
* Verstärkung der Expression der Hitzeschock Gene
29
Deaktivierung
* Denaturierte Proteine aus der Zelle entfernt
* DnaK-System steht wieder zur Verfügung
* DnaK-System reduziert die Translation des *rpoH* mRNA
* Bindet wieder an Sigma32
* Abschlatung der Hitzeschockantwort
30
Regulation Sigma 32 Zusammengefast
* Chaperonsystem erkennt bei Hitzeschock denaturierte Proteine
* Sigma32 Abbau ist abgelenkt, Sigma 32 bleibt frei und aktiv
* Erhöhte Translation, kann an RNAP binden
* Sigma Faktor ist auch zuständig für Expression der Chaperone
--\> Selbstreguliertes negatives Feedback System
MiBi MAP
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