méthode en histo

Question 1

pouvoir separateur oeil

Answer 1

Pouvoir séparateur = distance la plus petite entre deux points vus séparément

œil = 0,2mm (200μm)
MO = 0,2μm (200nm) ( cellule, organite)
ME = 0,2nm (molécule)

Question 2

different type echantillon
cellule vivante
frottis

Answer 2

1-1- Cellules vivantes
-> étude de la viabilité/vitalité cellulaire
pour repérer cell mortes (bleu trypan) ou cell vivantes (sondes fluorescentes)

1-2- Frottis - étalements / cytocentrifugation
pour les liquides ou produits de grattage ou brossage
sur lame

Question 3

different type echantillon

empreinte
préparation a plat

Answer 3

1-3- Empreintes / appositions
pour les échantillons solides
sur lame

1-4- Préparations à plat
pour les organes fins
sur lame / boite de Pétri

Question 4

different type echantillon

coupe

Answer 4

le plus souvent, organes trop épais pour observation directe au microscope
nécessité réaliser coupes fines/ultrafines
sur lame (MO) ou grille (MET)

Question 5

microscope optique préparation standart

differente etapes

Answer 5

= préparation d’un fragment de tissu solide pour examen en MO

Différentes étapes :
fixation 
inclusion 
coupe 
coloration 
montage

Question 6

MO prepa

fixation

Answer 6

(indispensable pour préserver les structures biologiques), fixateur : acide acétique, paraformaldéhyde

Question 7

MO prepa inclusion

Answer 7

pour « durcir » l’échantillon afin d’en permettre la coupe, après déshydratation dans des bains d’alcool dans de la paraffine fondu

Question 8

MO prepa coupe

Answer 8

coupes fines 2 à 10 μm avec un microtome

Question 9

MO prepa coloration

Answer 9

• Hématéine-Eosine (HE) : H -> noyaux en violet et E -> cytoplasme en rose
• Hématéine-Eosine-Safran (HES) : S -> fibres de collagène en jaune
• Trichrome de Masson : hématoxyline : noyaux en brun
  fuchsine acide : cytoplasme en rouge
  vert lumière : fibres de collagène en vert

Question 10

Le microscope optique à contraste de phase

Answer 10

optique a contraste de phase

• met en évidence les différences d’indices de réfraction
• en révélant des différences de phases de la lumière
• permet l’étude des cellules vivantes et préparations MÊME non colorées

Question 11

Le microscope à fluorescence

Answer 11

Fluorochromes = substances :

• source lumineuse avec sélection de lambda d’excitation
• filtres pour sélectionner les lambda d’émission

Question 12

Préparation des échantillons pour la ME à transmission (MET)

differente etape

Answer 12

fixation, inclusion, coupe, coloration = augmente contraste

Question 13

MEt prepa

fixation

Answer 13

• fixation : glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate (ou phosphate)
• post-fixation : acide osmique

Question 14

MEt prepa

inclusion

Answer 14

• après déshydratation

- dans des résines synthétiques

Question 15

MEt prepa coupe

Answer 15

• coupes ultrafines (50 à 80 nm)
• avec un ultramicrotome
• déposées sur des grilles de cuivre

Question 16

ME contraste

Answer 16

• acétate d’uranyle (pour noyau, nucléole et ribosomes)

- citrate de plomb (pour les membranes)

Question 17

Préparation des échantillons pour la ME à balayage (MEB)

differentes etape

Answer 17

fixation, déshydratation, métallisation

Question 18

MEb fixation

Answer 18

glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate pas de post fixation

Question 19

MEb deshydratation

Answer 19

• par des bains d’alcool de degré croissant

- et par passage au point critique du CO2

Question 20

MEb metallisation

Answer 20

dépôt d’une couche fine (10 nm) d’or-palladium

Question 21

hybridation in situ
= a quoi
pour quoi

Answer 21

= utilisation d’une sonde nucléique « marquée »
pour détecter et localiser,

dans les cellules ou les tissus,
une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN,
séquence complémentaire de celle de la sonde

Question 22

hybridation in situ

differente etape

Answer 22

1e tps : dénaturation de
l’ADN et de la sonde
2e tps : hybridation
3e tps : lecture, fonction
du « marqueur »

Question 23

hybridation in situ

sonde

Answer 23

La sonde est marquée par :

• des isotopes radio-actifs = « sondes chaudes »
• des produits non radio-actifs = « sondes froides »
• fluorochromes FISH = Fluorescence In Situ par Hybridation
• enzymes (phosphatase alcaline), biotine, digoxigénine
• or colloïdal pour MET

Question 24

Autoradiographie

= a quoi et pour quoi

Answer 24

= utilisation de précurseurs des macromolécules
marqués avec des isotopes radioactifs

pour repérer les sites de synthèse
et étudier le cheminement
de composés biologiques

Question 25

autoradiographie different temps

Answer 25

1e tps : incorporation in vivo / in vitro du précurseur du métabolisme à étudier 2e tps : confection des préparations 3e tps : autoradiographie (émulsion photosensible appliquée plusieurs semaines sur la préparation) 4e tps : développement et lecture du film (au microscope

Question 26

ME a transmission | capture image

Answer 26

Le microscope électronique à transmission - source de rayonnement = filament qui génère des électrons - lentilles = solénoïdes générant un champ électrique - recueil des électrons traversant la préparation - fonctionne sous vide - résolution supérieure car ldes électrons inférieure La capture d’images - film photo - caméra numérique

Question 27

ME a balayage

Answer 27

Le microscope électronique à balayage | - cf. MET mais recueil des électrons réfléchis par la préparation

Question 28

Histochimie

Answer 28

déceler et localiser, sur des préparations histologiques, les substances organiques et minérales, en particulier les constituants biochimiques (lipides, glucides et protides), à partir de réactions chimiques Glucides et réaction à l’acide périodique de Schiff (PAS) révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff -> coloration rouge pourpre

Question 29

histoenzymologie

Answer 29

= déceler / localiser des activités enzymatiques (et non les enzymes elles-mêmes) en mettant en évidence le produit de leur action sur un substrat spécialement fourni : 1e tps : incubation des cellules vivantes / coupes à congélation

Question 30

histo enzymo | a activite estérases

Answer 30

Activité des estérases (étude de la viabilité cellulaire) - la calcéine AM, substrat non fluorescent, traverse les membranes cellulaires ; - dans le cytoplasme des cellules vivantes, elle est estérifiée en calcéine ; - la calcéine est fluorescente et ne traverse pas les membranes cellulaires

Question 31

histo enzymo | a activité des peroxydases

Answer 31

Activité des péroxydases la péroxydase (endogène), en présence d’eau oxygénée oxyde la diaminobenzidine (DAB) -> précipité brun noir

Question 32

histoenzymo a activité ATPasique

Answer 32

Activté ATPasique L’ATPase, en présence de chlorure de cobalt-> phosphate de cobalt Phosphate de cobalt, en présence de sulfure d'ammonium, -> sulfure de cobalt qui précipite -> Les CMStSq « lentes » sont colorées en noir et les « rapides » en beige

Question 33

immunohisto | =

Answer 33

utilisation d’un anticorps (Ac), Ac monoclonal (AcM) essentiellement, pour détecter et localiser très spécifiquement 1 protéine

Question 34

Immunohisto complexe AG-AC | revele par quoi

Answer 34

- soit par un fluorochrome (techniques d’immunofluorescence) : Fluorescéine (FITC) emission : 520 nm Phycoérythrine (PE) emission: 580 nm - soit par une enzyme (techniques immunoenzymatiques) : ex péroxydase, phosphatase alcaline - soit par de l’or colloïdal

Question 35

Immunohisto complexe AG-AC revele par quoi pour la ME

Answer 35

par l’intermédiaire d’une protéine - soit de façon directe - soit de façon indirecte - parfois après amplification