TECNICHE DI STUDIO DI CAMPIONI CELLULARI
Due tecniche ben distinte di approccio allo studio della cellula e di campioni tissutali:
1. Approccio BIOCHIMICO: analizza le componenti cellulari;
- Approccio ISTOLOGICO: mantiene il più possibile integra la struttura del campione.
PRINCIPALI TIPI DI MICROSCOPIO
MO = Microscopio ottico composto (fonte di luce: luce visibile):
- Campo chiaro;
- Contrasto di fase;
- Interferenza;
- A fluorescenza;
- Confocale.
ME = Microscopio elettronico (fonte di luce: elettroni):
- TEM (a trasmissione);
- SEM (a scansione).
MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE E AD INTERFERENZA
- Compensano la trasparenza delle cellule non colorate mediante un aumento del contrasto.
- Tecniche basate sulle lievi differenze nell’indice di rifrazione che le cellule presentano.
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
- Il preparato viene illuminato con luce ultravioletta che è invisibile.
- Le cellule colpite dal fascio di luce UV emettono luce visibile –> fluorescenza.
- Fluorescenza:
1. Naturale (o autofluorescenza, quindi il caso precedente);
- Secondaria (è indotta colorando vari componenti cellulari con coloranti fluorescenti = fluorocromi).
MICROSCOPIO CONFOCALE
- Utilizzo di una sorgente luminosa laser.
- Presenza di una sistema ottico ed elettronico che permette di effettuare la scansione di una o più sezioni del campione osservato, ricostruendo poi sullo schermo di un computer l’immagine risultante.
MICROSCOPIO ELETTRONICO
- Strumento importante per lo studio della morfologia ultrastrutturale o submicroscopica dei tessuti.
- Basato sull’uso di un fascio di elettroni anziché di un fascio di luce visibile.
- Le lenti sono sostituite da un campo elettrostatico o elettromagnetico.
- L’immagine può essere:
1. Visualizzata su uno schermo fluorescente;
- Registrata attraverso acquisizione digitale.
Le immagini sono in bianco e nero.
Le parti scure si dicono “elettrondense”.
DIFFERENZE MICROSCOPI ELETTRONICI
Esistono due tipi:
- TEM (a trasmissione): il preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture interne;
- SEM (a scansione): il preparato NON è sezionato e sono visualizzate le strutture esterne, quindi la struttura 3D del campione.
SEM:
- Potere risolutivo più basso di TEM (circa 10 nm);
- Consente di valutare il rilievo degli oggetti;
- Impiegata per studiare: superficie delle cellule o di strutture pluricellulari.
- L’immagine deriva dal RIMBALZARE degli elettroni sulla superficie del campione in osservazione.
TEM:
- L’immagine deriva dall’ATTRAVERSAMENTO delle strutture biologiche dagli elettroni.
Es. Tra i due tipi di immagine c’è la stessa differenza che corre tra la fotografia di una persona (SEM) e la sua radiografia (TEM).
UNITÀ DI MISURA
mm = 10^-3 m
μm = 10^-6 m
nm = 10^-9 m
Å = 0,1 nm
Da = massa dell’idrogeno
Es. H = 1 Da
O = 16 Da
H2O = 18 Da
POTERE DI RISOLUZIONE
- Distanza minima dalla quale riusciamo a vedere 2 punti distinti come separati tra loro.
- Parametro più importante di un microscopio, non l’ingrandimento.
Grandezza influenzata da:
1. Lunghezza d’onda (della luce: bianca o blu);
- Apertura angolare (di una lente: a bassa o ad alta apertura);
- Indice di rifrazione.
Es. Occhio umano: ~ 0.1 mm
Microscopio ottico: ~ 0.2 μm
Microscopio elettronico: ~ 0.4 nm
PARAMETRI PER L’ESAMINAZIONE DI UN PREPARATO ISTOLOGICO
- Contrasto;
- Potere id risoluzione;
- Ingrandimento.
EQUAZIONE DI ABBÉ
r = 0,61 λ / n sen α –> r = 0,61 λ / NA
r = risoluzione
λ = lunghezza d’onda della luce visibile (400 - 700 nm):
- luce blu 450 nm,
- luce bianca 530 nm
n = indice di rifrazione del mezzo:
- Aria = 1,
- Olio = 1,5
α = apertura angolare della lente, cioè metà della larghezza angolare del cono di raggi raccolto dall’obiettivo:
- sen 70° = 0,94
- sen 60° = 0,87
n sen α = Apertura Numerica = NA
Es. Usando luce bianca:
r = (0,61 x 530) / 1 x 0,94 = 344 nm
Usando luce blu:
r = (0,61 x 450) / (1 x 0,94) = 292 nm
Usando luce blu con un obiettivo ad immersione in olio:
r = (0,61 x 450) / (1,5 x 0,94) = 195 nm
TIPI DI INGRANDIMENTO ED IMMAGINI
Ingrandimento con risoluzione: immagine “a fuoco”
Ingrandimento a vuoto: immagine “sfocata”
ELEMENTI MICROSCOPIO
- Sorgente luminosa (o filamento di tungsteno);
- Campione;
- Lenti (di vetro o elettromagnetiche).
IMMUNOFLUORESCENZA
Tecnica di immunoistochimica (si basa sul principio di coniugazione antigene-anticorpo).
Uso:
- Individuare se alcuni antigeni e anticorpi batterici o di origine virale sono presenti in un determinato campione.
Procedura:
- Presenza rilevata tramite l’uso di un colorante che rende fluorescenti gli anticorpi cercati.
Osservazione al:
- microscopio a fluorescenza OPPURE
- microscopio confcocale.
Due metodi:
- Diretto: la sostanza fluorescente è legata direttamente all’anticorpo prodotto contro l‘antigene cercato.
- Indiretto: Anticorpo primario che riconosce l’antigene cercato;
Anticorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che riconosce l’anticorpo primario.
IMMUNOISTOCHIMICA
In microscopia in campo chiaro:
- con l’utilizzo di un enzima che trasforma un substrato in un prodotto colorato;
In microscopia elettronica a trasmissione:
- con l’utilizzo di una sostanza densa agli elettroni OPPURE,
- in presenza di un enzima che trasforma un substrato in un prodotto denso agli elettroni.
IMMUNOLOCALIZZAZIONE
[al microscopio elettronico]
Tecnica dell’immunogold:
- Particelle sferoidali di oro colloidale (5-30 nm) coniugate con anticorpi specifici per l’antigene cercato.
- Ciascuna vista come un punto nero.
ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO
[microscopia ottica]
- Dissezione del materiale biologico;
- Fissazione:
- Aldeidi: formaldeide, formalina
- Alcooli: alcool etilico, alcool metilico
- Acidi: acido acetico, acido picrico - Disidratazione (con alcool etilico);
- Inclusione (lo scopo è ottenere campioni duri per il sezionamento):
- Cera: Paraffina
- Resine plastiche: resina epossidica - Sezionamento:
- Sezioni 3-10 μm di spessore - Reidratazione (con alcool etilico diluito e xilolo);
- Colorazione:
- Ematossilina: colorante basico e acidofilo
- Eosina: colorante acido e basofilo
ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO
[microscopia elettronica]
- Dissezione del materiale biologico in piccoli pezzi;
- Fissazione:
- Glutaraldeide
- Tetrossido di osmio - Disidratazione;
- Inclusione (lo scopo è ottenere campioni duri per il sezionamento):
- Resine plastiche (la paraffina altererebbe l’integrità dell’immagine) - Sezionamento:
- Ultramicrotomo (20-100 nm – fino a 1 μm)
Colorazione:
- Tetrossido di osmio
- Citrato di piombo
- Oro colloidale
FISSAZIONE
Uso:
- Immobilizzazione dei costituenti cellulari e tissutali del campione in uno stato più vicino possibile a quello di vita;
- Preservare i campioni dall’attacco di muffe o batteri, che distruggerebbero le strutture cellulari.
Fissazione:
1. CHIMICA (procedura che richiede circa due giorni)- soluzioni liquide (soluzioni isotoniche o pH fisiologico (7,4)) - Evitare collassamento o rigonfiamento dei campioni.
- FISICA (richiede pochi minuti) - congelamento (ghiaccio secco o azoto liquido (-170°C)) - Non si effettuano disidratazione ed inclusione, direttamente si passa al sezionamento.
FISSAZIONE FISICA
[congelamento]
Due step (passaggi):
- Congelamento-frattura (criodecappaggio o freeze-fracturing)
- Congelamento-incisione (crioincisione o freeze-etching)
Strumento: CRIOSTATO (taglio in temperature da 0°C fino a -45°C)
Uso:
- Conservare cellule vive, le quali una volta scongelate, riprendono le loro normali attività;
- Diagnosi istologica nel corso di un intervento chirurgico (estemporanea).
COLORANTI ISTOLOGICI
- Sostanze chimiche che si legano a costituenti cellulari aumentandone il contrasto per permettere il loro riconoscimento al microscopio.
COLORAZIONE VITALE E SOPRAVITALE
In entrambi i casi si usano COLORANTI VITALI.
Utilizzati direttamente su cellule vive (NON sottoposte a preparazione istologica), per studiare direttamente al microscopio:
- la localizzazione di determinate strutture cellulari;
- identificare particolari funzioni.
VITALE: Sono applicati ad animali viventi.
SOPRAVITALE: quando il colorante è usato per trattare tessuti o cellule isolate, ancora vive.
CLASSIFICAZIONE COLORANTI
BASICI: danno una colorazione BLU-VIOLA. - Ematossilina; - Blu di metilene; - Blu di toluidina. Reagiscono con ZONE ACIDE del tessuto: > Acidi nucleici (nucleo e citoplasmi particolarmente ricchi di mRNA) > Zone acide e cartilagini (GAG)
ACIDI: danno una colorazione ROSA-ARANCIO. - Eosina; - Orange. Reagiscono con SOSTANZE BASICHE: > Citoplasma; > Fibre di collagene.
In generale si usano entrambe le colorazioni (di solito ematossilina-eosina) per ottenere il contrasto tra le due zone.
CLASSIFICAZIONE COLORAZIONI
Due categorie:
1. Colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto epiteliale, collagene, ecc…);
- Colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).
