Definizione di morte cellulare
Processo articolato e differenziato che può seguire diverse strade: le due forme principali di morte sono la necrosi e l’apoptosi
Differenza Necrosi e Apoptosi
- Necrosi:
– Molecolarmente Meno complessa dell’apoptosi
– rigonfiamento osmotico cellulare e degli organuli che porta amorte per “esplosione”
– elementi cellulari digeriti attraverso processo proteolitico degli enzimi litici liberati da esplosione lisosomi
– Flogosi data da liberazione componenti cellulari (DAMPs) - Apoptosi
– raggrinzimento cellula senza rottura MB: formazione frammenti cellulari inclusi in membrana (corpi apoptotici)
– corpi apoptotici eliminati da fagociti con efferocitosi
Necrosi
- Definizion
- Fenomeni reversibili
- Alterazioni permanenti
- Clinica
Necrosi, anche definita “morte accidentale”, rappresenta una risposta mortale a condizioni patogene estreme, queste ultime possono corrispondere a insulti ischemici, tossine, patogeni chimici, fisici o ambientali.
- Inizialmente: processi di alterazione morfologica reversibile rispetto a situazione morfologica => se rimozione noxa si ha ripristino
– Formazione di estroflessioni (blebs) della membrana plasmatica;
– Rigonfiamento generalizzato dei compartimenti intracellulari delimitati da membrana tra cui le vescicole del reticolo con conseguente distacco e dispersione dei ribosomi;
– Comparsa di alterazioni a livello nucleare in cui si assiste all’addensamento della cromatina, osservabile nei preparati istologici per via della colorazione intensa dell’acido nucleico addensato con il colorante ematossilina;
– Aggregazione di elementi del citoscheletro;
– Steatosi: consiste in accumulo di materiale grasso, in particolare trigliceridi, in tessuti che in condizioni fisiologiche non sono soggetti a questo fenomeno, bensì sono solitamente coinvolti nel metabolismo dei lipidi. I tipi cellulari in questione sono dunque: epatociti e miociti del muscolo cardiaco soprattutto ma anche del muscolo scheletrico. I tipi cellulari citati, in particolare gli epatociti, sono coinvolti nella manipolazione delle lipoproteine e per questo soggetti al fenomeno di steatosi.
- Poi se noxa non viene meno si ha processo di esplosione (cariolisi e frammentazione MB sono punti di non ritorno)
– rigonfiamento cellulare più marcato;
– frammentazione della membrana plasmatica con rilascio di componenti cellulari;
– rottura lisosomiale con rilascio di enzimi proteolitici che digeriscono proteine della cellula stessa determinando il fenomeno di autolisi;
– lisi del reticolo endoplasmatico;
– grave rigonfiamento mitocondriale in cui si susseguono vari eventi, tra cui depolarizzazione della membrana mitocondriale che esita nella lisi del compartimento mitocondriale stesso;
– alterazioni nucleari più importanti distinti in base all’aspetto morfologico in: picnosi, contrazione del materiale genetico nucleare ed intesa come lo stadio avanzato dell’aggregazione della cromatina iniziata nella fase reversibile, pertanto il nucleo si riduce di dimensione e si colora più intensamente con l’ematossilina; cariolisi, degradazione definitiva del materiale genetico a seguito della quale il nucleo non risulta più colorabile con ematossilina; carioressi, frammentazione del materiale
nucleare.
- Necrosi ha ambito clinico: DAMP liberati usati come parametri ematochimici (es. cardiopatie ischemiche (infarto, angine stabili e instabili) e troponine T e I / epatite e transaminasi)
Fasi della necrosi
- Evento determinante: crisi bioenergetica cellulare: alterazione della funzione mitocondriale data dal rigonfiamento e quindi dalla perdita delle creste mitocondriali =>
– deplezione ATP (e morte a bassa energia) con livelli sotto il 10% solitamente presente
1. Perdita omeostasi ionica-volumetrica
2. Aumento prolungato nel tempo del Ca2+ citosolico (al contrario di quello normale e breve del calcium signaling). [Ca2+] mantenuto da:
– pompa SERCA (Ca da citosol a REL)
– PMCA (Ca da citosol a spazio extracellulare)
– canale uniporto calcio mitocondriale senza dispendio di energia ma che sfrutta gradiente ATP e H+ => se gradiente perso, perdita regolazione entrata calcio
3. Attivazione proteasi/endonucleasi/ATPasi/Fosfolipasi Ca2+ dipendenti che provocano danno alla struttura cellulare
4. Feedback positivo: si instaura circolo vizioso con potenziamento retroattivo processi di danno cellulare
– ATPasi Ca2+ - dipendenti incrementano la deplezione di ATP e quindi accentuano la crisi bioenergetica già in corso,
– le fosfolipasi che agiscono sulla membrana incrementano l’alterazione dell’equilibrio osmotico causando un ulteriore rigonfiamento,
– le proteasi possono agire sulle componenti strutturali del citoscheletro peggiorando i danni alla membrana mentre
– le endonucleasi agiscono degradando gli acidi nucleici
Esempi di tessuti necrotici
- Necrosi caseosa caratterizza prevalentemente le lesioni tubercolari a livello polmonare. Inquesto caso l’area di necrosi, costituita dalle cellule uccise dall’infezione provocata dal Mycobacterium tuberculosis, appare biancastra e di consistenza molle, caratteristiche dalle quali deriva il nome.
- Necrosi coagulativa si verifica tipicamente a seguito di danno di tipo ischemico. Inquestocaso le cellule necrotiche danno origine ad un’area di consistenza dura a causa della coagulazione e
dell’aggregazione delle proteine contenute in queste cellule. - Necrosi a cuneo a seguito dell’ischemia di un ramo arterioso.
- Necrosi colliquativa si verifica ad esempio nel cervello ed è caratterizzata dalla liquefazione del tessuto necrotico.
- Necrosi adiposa è un tipo particolare di necrosi che si verifica, ad esempio, nelle pancreatiti. È determinata dal fatto che la morte delle cellule esocrine del pancreas porta alla liberazione di tutti gli enzimi contenuti al loro interno, tra cui quelli deputati alla digestione dei lipidi. Questi enzimi digeriscono i lipidi circostanti portando alla saponificazione dei trigliceridi presenti in questi distretti.
- La necrosi fibrinoide è tipica di molte malattie immunomediate, alcune delle quali sono caratterizzate da alterazioni vascolari come le arteriti. Queste sono dovute, ad esempio, al deposito di immunocomplessi nella parete vascolare, con conseguente attivazione di processi infiammatori, i
quali portano ad una necrosi fibrinoide della parete vascolare.
Gangrena
- Definizione
- Causa
- Tipologie
- Distretto necrotico esteso che genera complicanze
- Causata da evento ischemico / cause infettive
- Forme:
– secca: (non complicata) necrosi determinata da evento ischemico (tipica dei pazienti diabetici non controllati).
1. colore rossastro dell’area
2. colorazione nerastra con aspetto mummificato
– umida: complicazione della gangrena secca che avviene quando area necrotica si infetta, con colliquazione tessuto con emissione secrezione sierosa e materiale maleodorante a seconda del patogeno
– gassosa: infezione di zone gangrenose da p.te di batteri a metabolismo anaerobico. Tipico dei tessuti profondi (fasce muscolari) in cui batteri liberano piccole bolle gassose
Apoptosi
- definizione
- funzioni
- L’apoptosi, morte programmata e ad alta energia, è un programma genetico di suicidio cellulare
- Principale meccanismo
– controllo preciso dell’omeostasi numerica dei tessuti (x eliminare cellule di troppo)
– sviluppo embrionale (es. formazione dita: se deficit => sindattilia)
– tolleranza immunologica centrale e periferica (eliminazione cloni autoreattivi)
– condizioni patologiche (eliminazione cellule potenzialmente dannose con dato numero mutazioni genetiche controllato da LinfT CTL)
– a cui sono resistenti le cellule tumorali
– malattie neurodegenerative, in quanto portano a distruzione neuroni
Induzione Apoptosi
- Via estrinseca o recettoriale
- Via intrinseca
- Via estrinseca: segnale di suicidio cellulare è fattore solubile pro-mortale proveniente dall’esterno della cellula, che ingaggia particolari recettori di membrana , chiamati death receptors, con l’attivazione di una serie di adattatori per attivare macchinario intracellulare che porta all’esecuzione del programma apoptotico.
- Via intrinseca o mitocondriale: proveniente dall’interno; in questo caso il segnale non dipende da recettori ma proviene dall’interno della cellula andando a innescare una cascata di eventi attraverso i mitocondri (diversi tipi di stress cellulari che alterano l’omeostasi):
– accumulo di mutazioni genetiche, danni irreversibili al DNA che non possono venire riparati,
– accumulo di proteine non ripiegate correttamente nel reticolo endoplasmico,
– elevati livelli di specie reattive dell’ossigeno,
– deplezione dei fattori di crescita “pro- survival”.
Segnali attivano il processo apoptotico controllando l’attività delle proteine appartenenti alla famiglia di Bcl-2, le quali controllano alcune funzioni chiave dei mitocondri.
Mediatori segnale apoptotico
- Caspasi
- Attivate grazie a vie estrinseca ed intrinseca
- Proteasi che trasducono segnale apoptotico con taglio molecola a valle
- Classificazione:
– Iniziatrici: recepiscono il segnale e lo trasmettono con taglio proteolitico
– Esecutrici: attivano il pathway per la distruzione cellulare (caspasi interagiscono reciprocamente per attivarle)
Fasi grossolane Apoptosi
- Distruzione componenti citoscheletro
- Formazione corpi apopototici
- Attivazione endonucleasi per frammentazione DNA cellulare (diversa da necrosi)
Via intrinseca apoptosi
- Coordinata da mitocondri che hanno prot in spazio intermembrana che se lasciate avviano via intrinseca. Proncipale: Citocromo C
- Rilascio citocromo in citosol controllato da prot. famiglia Bcl-2 (20 prot) (gene alterato in traslocazione cromosomica in linfomi di cellule B)
- Mitocondri rilasciano proteine inibitrici delle IAPs quando si formano i pori x evitare che disattivino caspasi inattivando apoptosi
- Formazione apoptosoma: complesso eptamerico tridimensionale che ricorda una ruota con i raggi.
– Subunità = citocromo c + Apaf1
1. Segnali pro-apoptotici
2. Formazione poro di Bcl-2 e rilascio Citocromo c in citosol
3. Rilascio inibitori IAPs
4. Formazione Apoptosoma
Elenco prot mitocondriali e funzioni apoptotiche
- Citocromo C ha doppia funzione
– in catena respiratoria se in spazio intermembrana
– in via intrinseca se in citosol - Smac-diablo: inibitore degli inibitori di caspasi apicali ed effettrici
- Endonucleasi G: media distruzione del patrimonio genetico della cellula che fa apoptosi. In citosol si dirige in nucleo
- ATP: necessaria a caspasi per loro funzioni (morte ad alta energia: stesso stimolo può causare apoptosi se alta [ATP] o necrosi se bassa [ATP])
Famiglia di Bcl-2
24 prot:
- 19 pro-apoptotiche: divise in sottofamiglia
– Bax: pore forming su MME multimerizzando (ancorate a MME) (poro per eteromultimerizzazione Bax-Bok o solo per omomultimerizzazione Bax)
– BH3 only non pore forming: funzione regolatoria senza essere ancorate a MME (no dominio TM solo dominio BH3) (non essenziali al processo apoptotico). Bid è la principale e induce multimerizzazione Bax (tBid è forma attiva)
- 5 anti- apoptotiche regolatrici ancorate a MMExt tramite dominio transmembrana
– espresse differenzialmente in tessuti diversi e cellule tumorali
Interazione proteine apoptosi
Inibitori apoptosi:
- Bcl2
- MCL1
- ….
BH3 only inibiscono gli inibitori apoptosi se attivati da specifico segnale pro-apoptotici:
- Bad e Noxa hanno target specifici
- Bid, Puma e tBid hanno spettro d’azione + ampio (inibiscono tutte prot-antiapoptotiche)
Segnali pro-apoptotici:
- danno DNA
- Stress bioenergetico
- deprivaz GF
- Ipossia
Caspasi attivate hanno processo di feedback: + sono attivate e + stimolano inibitori degli inibitoi apoptotici
- Caspasi 8 attiva Bid clivandolo = Punto convergenza via estrinseca ed intrinseca)
Attivazione proteine pro-apoptotiche
Bim
– inibito da fosforilazione da Erk,
– Erk attivato da MEK
– MEK attivata da Raf (pathway inibizione pro-survival)
Bmf:
– inibita per sequestro fisico da pte di DLC-2
– DLC-2 lega miosina 5 che lega citosch.
Bad
– fosforilata per essere sequestrata e quindi inattivata
– Fosforilazione da pte di Akt
Bid
– attivazione taglio proteolitico da pte di caspasi 8 o granzima B
Rimodellamento delle creste mitocondriali
- FORMA CRESTE
- AGENTE RIMODELLANTE
Struttura fisoilogica delle creste AMPOLLARE
- Rimodellamento ad azione OPA1
- OPA1 attivata da taglio con OMA1
Fattori che favoriscono rilascio massivo di CitC
- Apertura canale Bax/Bak
- Rimodellamento delle creste
Smac Diablo
- Ruolo
- Sede
- Inibitore delle IAPs
- Legata a MM rivolta vs spazio intermembrana marilasciata da poro Bax/Bak
- Mobilizzata da PARL (proteasi)
Apoptosoma e suo effetto
Formato da citocromo C quando esce dal mirtocondrio:
- Apaf1 (citosolico): raggio
- Procaspasi 9: centro ruota poi attivato per prossimità
- Caspasi esecutrici (3,6, 7) sono attivate da caspasi 9 x taglio proteolitico
- Caspasi esecutrici inibite da IAPs
- IAPs inibite da Smac/DIABLO rilasciato da mitocondrio
Proteine bersaglio caspasi 3,6,7
- Clivare prot. bersaglio (substrati mortali) x Distruzione cellula apoptotica
Substrati mortali
- elenco
- Effetti
- prot. citoscheletriche (actina e vimentina)
- laminina della membr nucl
- ICAD (inibitore nucleasi) rimosso per ripristino attività delle DNasi
Effetti: - Blebs e corpi apoptotici
- alteraz. cromatina e frammentaz. DNA
Eventi nucleari apoptosi
- Attivazione endonucleasi
– Endonucleasi G
– CAD (caspase activated DNAse) inibita d ICAD - Frammentazione DNA negli spazi internucleosomiali (segmenti generati tutti multipli di 180bp)
- Frmmentazioni laminina => alterazioni nucleari
Test per stabilire tipo di morte di una cellula
- Elettroforesi dei frammenti di DNA
- Test per marcare nucleotidi fluorescenti (X-dUTPs)
- Perdita di simmetria dei fosflolipidi di membrana analizzando % fosfodiesterina sui due foglietti
Via estrinseca
- Recettori mortali
- Attivazione da legame con ligando
- Recettori mortali:
– FAS che lega FASL
– DR4, DR5 ingaggiati da molecola proapoptotica TRIAL
– TNFR1 attivato dopo stimoli tumorali
– DR3 che lega TNF - Legame con ligando induce formazione trimeri (rec. Tirosinchinasici formano dimeri)
– attivazione FADD (prot associata a FAS e con dominio di morte)
– FADD forma piattaforma attivatoria x caspasi apicali 8 (princ.) e 10: DISC (death induced signaling complex) (FLIP+TRADD+FADD+Caspasi 8)
1. legame death-ligand e death-receptor
2. Attivazione FADD
3. attivazione delle caspasi apicali 8 e 10 mediante DISC
4. Attivazione mediante taglio delle procaspasi
5. azione sui death substrates
