random pitanja

Question 1

Dvije metode za određivanje glukoza-6-fosfata i dvije za mlijecnu kiselinu. nacrtaj molekule objasni princip metoda.

Answer 1

Glukoza-6-fosfat
V/Vis spektrofotometrija (s G6P dehidrogenazom)
- G6P se oksidira u 6-fosfoglukonolakton katalizom enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD), pri čemu se koenzim NADP⁺ reducira u NADPH. NADPH apsorbira svjetlost na 340 nm, što omogućuje njegovu kvantifikaciju spektrofotometrijom.
G6P + NADP⁺ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺
NMR spektroskopija (¹H ili ³¹P NMR)u ekstraktu stanica
¹H NMR prati karakteristične signale protona u glukozi
³¹P NMR izravno prati fosfatne skupine; fosfat G6P daje specifičan signal.

Laktat
UV/Vis spektrofotometrija (s laktat dehidrogenazom, LDH)
- Laktat se oksidira u piruvat uz redukciju NAD⁺ u NADH. Povećanje apsorbancije NADH-a na 340 nm proporcionalno je koncentraciji laktata.
Laktat + NAD⁺ → Piruvat + NADH + H⁺
HPLC (kvantifikacija organske kiseline)
- Laktat se može odrediti pomoću visokotlačne tekućinske kromatografije (HPLC), najčešće s eluacijom na reverzno-faznoj koloni, nakon čega se detektira UV-om (npr. na 210 nm). Razdvajanje se temelji na razlikama u hidrofobnosti i elucijskim vremenima laktata i ostalih kiselina u uzorku.

Question 2

Objasni regulaciju složenih metaboličkih puteva na razini aktivnosti enzima.i sheme duh

Answer 2

1. IZOENZIMI
    2 ili više enzima koji kataliziraju istu reakciju
   o razlikuju se po strukturi (primarna,…,podjedinice i kofaktori) i načinu regulacije (aktivnost svakog enzima kontrolirana je različitim krajnjim produktom)
   o npr. 3 aspartat kinaze kod E. coli; aktivnost jedne kontrolirana je lizinom, aktivnost druge treoninom i aktivnost treće metioninom
2. USKLAĐENA (kooperativna, multivalentna) REGULACIJA POVRATNOM SPREGOM
    1 enzim čija je aktivnost regulirana sa više efektora
    npr. sineza izoleucina, valina, leucina i pantotenske kiseline kod bakterije Salmonella
   typhimurium
3. KUMULATIVNA REGULACIJA
    svaki proizvod metaboličkog puta djeluje sam za sebe u određenom postotku na
   aktivnost enzima
    učinak proizvoda je kumulativan
    npr. aktivnost glutamin sintetaze regulirana je sa 8 različitih spojeva

Question 3

Definiraj operon, regulon, modulon, alarmon, stimulon.

Answer 3

OPERON=funkcionalna genetička jedinica koja sadrži regulacijske i strukturne gene - osnovna transkripcijska jedinica iz koje se proizvodi jedna, u pravilu,
policistronska mRNA sa pojedinačnog promotora.
REGULON= grupa operona koju kontrolira zajednički
regulacijski protein.
 operoni koji čine regulon u pravilu su bez nekog reda razmješteni po genomu npr. glp-regulon
MODULON= grupa regulona i/ili u kojoj je svaki član grupe pod kontrolom zajedničkog
globalnog proteina.
ovaj sustav je epistatički („epistaza“zaustavljanje; u genetici, sprječavanje funkcije
jednog gena genom iz istog genotipa, ali udaljenijeg genskog položaja koji upravlja
izgradnjom nekog svojstva; sprječavanje jednog gena genom homolognog genskog
položaja definira se kao dominantnost)nadređen pojedinačnim regulatorima
mutacija u globalnom regulatoru daje pleiotropni efekt (pojava da jedan gen
istovremeno utječe na formiranje više osobina)
 npr. crp-modulon (eng. cyclo-AMP receptor protein ili catabolite repression protein)
ALARMON=mala molekula koja signalizira stresno stanje pa tako djeluje kao globalni regulator
STIMULON= velika grupa operona koji reagiraju na istu pojedinačnu pobudu, a da pri tome
nisu regulirani djelovanjem zajedničkog regulacijskog proteina
 primjeri pobude: glad, toplinski šok, oštećenje DNA, infekcija fagom

Question 4

Što je primarni, a što je sekundarni metabolizam?

Answer 4

PRIMARNI METABOLIZAM je metabolizam u kojem nastaju spojevi povezani s rastom i
funkcioniranjem stanice, tzv. primarni metaboliti kao što su etanol, laktat, acetat, tirozin,
fenilalanin, triptofan, glutamat/glutamin, lizin, metionin, izoleucin.
SEKUNDARNI METABOLIZAM obuhvaća kemijske reakcije u kojima nastaju spojevi koji
nisu esencijalni za rast i razmnožavanje odnosno funkcioniranje stanica, tzv. sekundarni
metaboliti kao što su enzimi, antibiotici, terapeutski proteini i sl.

Question 5

Nabrojite tipove pasivnog transporta.

Answer 5

1. Pasivna difuzija kroz lipidni dvosloj
   Pasivna difuzija je spontano kretanje malih, nepolarnih molekula (npr. O₂, CO₂, urea, benzen) kroz fosfolipidni dvosloj, bez pomoći membranskih proteina i bez utroška energije. Brzina difuzije ovisi o koncentracijskom gradijentu i opisuje se Fickovim zakonom. Kemijska specifičnost ne postoji, a brzina difuzije neznatno raste s temperaturom, ali raste povećanjem fluidnosti membrane.
2. Pasivna difuzija kroz poru
   Ovdje se prijenos tvari odvija pomoću proteinskih pora (kanala) koje omogućuju prolazak polarnih molekula ili iona niz koncentracijski gradijent. Nema kemijske specifičnosti ni kompetitivne inhibicije, a kinetika također slijedi Fickov zakon. Transport je nešto selektivniji nego kroz čisti lipidni dvosloj, ali i dalje ne zahtijeva energiju.
3. Olakšana difuzija (uniport)
   Olakšana difuzija uključuje specifične transportne proteine (permeaze) koji prenose jedan supstrat niz njegov gradijent koncentracije. Ovaj transport pokazuje kemijsku specifičnost i zasićenje te se opisuje Michaelis-Menten kinetikom, slično kao enzimatske reakcije. Brzina prijenosa ovisi o temperaturi, a sustav može biti inhibiran strukturnim analozima supstrata ili inaktiviran mutacijama proteina.

Question 6

Nabrojite tipove aktivnog transporta.

Answer 6

4. Primarni aktivni transport (ovisan o ATP-u)
   Primarni aktivni transport koristi energiju hidrolize ATP-a ili druge kemijske reakcije (npr. fotokemijske, dekarboksilacijske) kako bi se tvari prenosile protiv njihova koncentracijskog gradijenta. Transport posreduju enzimi (kinaze, ATP-aze) koji istodobno prenose i fosforiliraju supstrate. Proces je visoko specifičan, ima saturaciju i ovisi o optimalnom temperaturnom rasponu.
5. Kemiosmotski transport (sekundarni aktivni transport)
   Kod kemiosmotskog transporta energija prijenosa ne potječe izravno iz ATP-a, nego iz elektrokemijskog gradijenta protona (H⁺) koji je prethodno stvoren npr. respiratornim lancem. Može biti u obliku simporta (oba supstrata u istom smjeru) ili antiporta (supstrati u suprotnim smjerovima). Proces je kemijski specifičan, slijedi Michaelis-Menten kinetiku i može biti inhibiran strukturnim analozima.
6. PTS – fosfotransferazni sustav (vektorska fosforilacija)
   PTS je oblik aktivnog transporta specifičan za prokariote, kod kojega se supstrat tijekom prijenosa kroz membranu istodobno fosforilira. Izvor energije nije ATP nego fosfoenolpiruvat (PEP), koji donira fosfat preko niza proteina (EI, HPr, EIIA, EIIB, EIIC).
   Sustav je visoko specifičan za supstrat, kinetika mu slijedi Michaelis-Menten model, a brzina ovisi o temperaturi.

Question 7

Dvije metode za odredit konc glukoze i jednu objasnit te nacrtat

Answer 7

Enzimska UV/Vis (HK + G6PDH, A₃₄₀)
Princip
Glukoza se najprije fosforilira u glukoza-6-fosfat (G6P) pomoću heksokinaze (HK), a zatim se G6P oksidira pomoću glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PDH) uz redukciju NADP⁺ → NADPH. NADPH ima maksimum apsorbancije na 340 nm, pa se porast A₃₄₀ koristi za kvantifikaciju glukoze (preko standardne krivulje).
Glukoza + ATP ──HK──▶ G6P + ADP
G6P + NADP⁺ ──G6PDH──▶ 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H⁺
Mjeri se ΔA na 340 nm ∝ [NADPH] ∝ [glukoza].

HPLC (druga metoda – samo ukratko)
Uzorak se razdvoji na RP ili HILIC koloni; za detekciju se koristi RID (refraktometrija) ili UV 200–210 nm.
Identifikacija: po retencijskom vremenu u odnosu na standard glukoze.
Kvantifikacija: površina pika vs. kalibracijska krivulja.

Question 8

Dvije metode za koncetraciju etanola te objasnit

Answer 8

UV/Vis spektrofotometrija – enzimatska metoda s alkohol dehidrogenazom (ADH)
Etanol se oksidira u acetaldehid pomoću enzima alkohol dehidrogenaze (ADH), uz redukciju koenzima NAD⁺ u NADH.
Etanol+NAD+→Acetaldehid+NADH+H+​
NADH apsorbira svjetlost na 340 nm, dok NAD⁺ ne.
Porast apsorbancije pri 340 nm proporcionalan je koncentraciji NADH, odnosno početnoj koncentraciji etanola.
Uzorak se stavlja u kivetu, mjeri se promjena apsorbancije, a koncentracija se određuje prema standardnoj krivulji.

1. HPLC (tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti) – detekcija refraktometrom (RID)
   Uzorak koji sadrži etanol ubrizgava se u HPLC sustav.
   Etanol se odvaja na koloni (često na reverzno-faznoj koloni C18 ili na ion-izmjenjivačkoj koloni).
   Detektira se pomoću refraktometrijskog detektora (RID) koji mjeri promjenu indeksa loma svjetlosti pri izlazu spoja iz kolone.
   Retencijsko vrijeme i površina pika uspoređuju se sa standardima etanola.
   Koncentracija se određuje preko kalibracijske krivulje.

Question 9

Dvije metode za octenu

Answer 9

Uzorak koji sadrži octenu kiselinu filtrira se i ubrizgava u HPLC sustav.
Odvajanje se najčešće provodi na ionsko-izmjenjivačkoj koloni (npr. Aminex HPX-87H) u kiselom puferskom sustavu (eluent: 5 mM H₂SO₄).
Octena kiselina se iz kolone eluirа kao individuаlni pik.
Detekcija se može izvesti:
UV/Vis detektorom na ~210 nm (karboksilne kiseline apsorbiraju pri toj valnoj duljini)
RID detektorom (refraktometrija) ako je uzorak kompleksan ili ako se želi kvantifikacija više organskih kiselina istovremeno.
Koncentracija se određuje na temelju površine pika i standardne krivulje s poznatim koncentracijama octene kiseline.

UV/Vis spektrofotometrija – enzimatska metoda s acetat kinazom i piruvat kinazom
Princip (dvostupanjska enzimatska reakcija):
Reakcija acetat kinaze (AK):
Acetat+ATP→Acetil-fosfat+ADP
Reakcija piruvat kinaze (PK) i laktat dehidrogenaze (LDH):
ADP+PEP→ATP+Piruvat
Piruvat+NADH+H+→Laktat+NAD+
Tijekom reakcije dolazi do oksidacije NADH u NAD⁺, što se prati smanjenjem apsorbancije na 340 nm.
Smanjenje apsorbancije proporcionalno je početnoj koncentraciji octene kiseline u uzorku.
Na temelju kalibracijske krivulje možemo izračunati koncentraciju acetata.

Question 10

Objasni princip HPLC-a.

Answer 10

High Performance Liquid Chromatography -visokoučinkovita tekućinska kromatografija
- uglavnom se koristi u analitičke svrhe
- razlika od klasične tekućinske kromatografije je to što su kuglice stacionarne faze vrlo malog promjera, gušće su nabijene i pružaju veći otpor pa je pri pročišćavanju potrebno upotrijebiti više tlakove, zbog toga je sama aparatura
kompliciranija, a materijal za SF izdržljiviji
- princip: vrlo čisti uzorak, pročišćen filtracijom kroz nitrocelulozne filtere, injektira se u MF te prolazi kroz kolonu punjenu SF; komponente uzorka ulaze u interakcije s MF i SF što određuje brzinu eluiranja tj. vrijeme zadržavanja pojedinih komponenti unutar kolone; daljnjim eluiranjem s MF, uzorak dolazi do detektora koji detektira mjerni signal

Question 11

Objasni princip UV/Vis spektrofotometrije.

Answer 11

• ukazuje na prisutnost п-konjugiranih elektronskih sustava u ispitivanoj molekuli (konjugirani sustav= organski spoj sa sp² hibridiziranom ugljikovom okosnicom tj. konjugiranim slijedom dvostrukih veza); UV zračenje apsorbiraju bezbojni spojevi koji sadrže dio molekule zvan KROMOFOR
• uzrokuje pobuđivanje valentnih п-elektrona kao i nevezanih elektrona te uzrokuje njihov prijelaz u više energetske nivoe - prolazak UV zračenja kroz molekulu uzrokuje pobiđivanje elektrona uz njihov prelazak iz najviše popunjene molekulske orbitale u najnižu nepopunjenu (HOMO-LUMO)
• princip - izvor emitira zračenje u UV i Vis spektru koje prolazi kroz monokromator gdje dolazi do disperzije svjetlosti na zrake različitih valnih duljina. Te zrake svjetlosti dolaze uzorka gdje dio zraka prolazi kroz uzorak a dio se apsorbira. Prolazak UV zračenja kroz molekulu uzrokuje pobiđivanje elektrona uz njihov prelazak iz najviše popunjene molekulske orbitale u najnižu nepopunjenu (HOMO-LUMO). Zrake svjetlosti koje su prošle kroz uzorak dolaze na detektor nakon čega se vrijednosti
  intenziteta propuštene svjetlosti i intenziteta upadne svjetlosti prikazuju kao omjer zvan apsorbancija. Preko Beer-Lambertovog zakona (A=εcl; koncentracija tvari (c), molarni apsorpscijski koeficijent (ε) i duljina optičkog puta (kivete u kojoj je uzorak) (l)) možemo zatim doći do koncentracije tvari u uzorku.

Question 12

Navedite sve tipove transporta koji se mogu (1) onemogućiti uvođenjem mutacije i (2)
inhibirati strukturnim analozima.

Answer 12

Transporti koji se mogu onemogućiti mutacijom

To su svi oblici transporta kod kojih sudjeluju membranski proteini → jer mutacija u genu znači gubitak ili promjenu proteina → transport prestaje.
✔ Pasivna difuzija kroz poru (jer pora = proteinski kanal)
✔ Olašana difuzija (uniport)
✔ Aktivni transport ovisan o ATP-u (pumpa)
✔ Kemiosmotski transport (npr. antiport, simport)
✔ PTS (prijenos uz vektorsku fosforilaciju)
Ne može se onemogućiti mutacijom:
✘ Pasivna difuzija kroz lipidni dvosloj – jer ne koristi protein, već se molekule otapaju u membrani i prolaze neovisno o genomu.

Transporti koji se mogu inhibirati strukturnim analozima

To su oblici transporta gdje postoji kemijska specifičnost → znači da protein prepoznaje supstrat, pa ga analog može blokirati.
✔ Olašana difuzija (uniport)
✔ Aktivni transport ovisan o ATP-u
✔ Kemiosmotski transport (npr. proton-motivirana simport/antiport)
✔ PTS sustav (jer supstrat ulazi i fosforilira se → specifično prepoznavanje)

Question 13

Navedite jednu metodu kojom biste mogli popratiti povećanu sintezu i sekreciju
heterolognog proteina u stanicama transformiranog domaćina i ukratko opišite princip
primjene te metode.

Answer 13

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA je imunokemijska metoda koja omogućuje specifičnu i kvantitativnu detekciju proteina pomoću antitijela. Ako želimo pratiti povećanu sintezu i sekreciju heterolognog proteina, uzorak kultivacijskog supernatanta se inkubira u mikroploči čija su udubljenja obložena antitijelom specifičnim za ciljani protein. Nakon vezanja proteina, dodaje se sekundarno antitijelo vezano za enzim. Dodatkom supstrata enzim proizvodi obojeni ili fluorescetni produkt, a intenzitet signala proporcionalan je koncentraciji proteina. Mjerenjem apsorbancije u mikrotiterskom čitaču moguće je kvantificirati točnu količinu sekretiranog proteina.

specifična za određeni antigen vezan na stijenku mikrotitarske ploče; uzorak koji može i ne mora sadržavati antigen stavlja se u jažicu pri čemu se antigen, ako je prisutan, veže na antitijelo; zatim se dodaje sekundarno antitijelo s enzimom koje se onda veže na kompleks antigen-antitijelo; dodavanjem supstrata za taj enzim omogućuje nastajanje produkta koja je koncentracija proporcionalna koncentraciji antigena, a određuje se spektrofotometrijski
- 2. indirektna metoda: služi za detekciju antitijela u
serumu; ovdje je antigen vezan za mikrotitarsku ploču, a dodaje se serum s antitijelom; višak antitijela te nevezana antitijela se ispiru; detekcija se ponovno vrši sekundarnim antitijelom s vezanim enzimom, ali se sada sekundarno antitijelo veže na primarno; dodatkom supstrata tog enzima dobiva se obojeni produkt koji se detektira spektrofotometrijski

Question 14

Različiti tipovi aldolaza kataliziraju određene reakcije u nekoliko metaboličkih puteva razgradnje ugljikohidrata u stanicama industrijskih mikroorganizama. Napišite barem tri takve reakcije.

Answer 14

glikoliza
aldolaza - fruktoza-1,6-bisfosfat u gap i dhap

ukljucivanje fruktoze u glikolizu
fruktoza-1-fosfat aldolaza - f-1-p u gliceraldehid i dhap

put pentoza fosfata
transaldolaza - gap+sedoheptuloza-7-p u f-6-p i eritroza-4-p