Was können Reporter- und Markergene ?
Nachweis und Selektion von zu untersuchenden Ereignissen oder Eigenschaften von biologischen Substanzen bzw Organismen
- Markergene sind idR dominant
- Reportergene nicht dominant selektiv
Was sind die Anforderungen/Merkmale an Reporter- bzw Markergene?
- Selektierbarkeit
- Quanitifizierbarkeit
- möglichst einfacher (nicht nicht $) Nachweis
- Nachweis in lebenden Organismen
- hohe Sensitivität bzw optische Auflösung
Wofür werden Reporter- und Markergene angewendet?
- Selektionsmarker
- Bestimmung von Enzymaktivitäten
- Expresionsmuster und- stärke von Genen
- Lokalisation von Proteinen in Zellen und Geweben
Wofür werden Selektionsmarker eingesetzt?
- Transformierte Zellen, Gewebe bzw Organismen (Antibiotikaresistenz, auxotrophe Marker..)
- Klonierungsereignisse (β-Galactosidase)
Welche wichtigen Reportergene gibt es?
- β-Galactosidase
- β-Glucuronidase
- Luciferase
- Green flourescent protein (GFP)
Was ist das Problem bei β-Galactosidase?
Ist nicht nutzbar in Pflanzen, da sie sowieso Beta-Galactosidase haben
- eine endogene β-Galactosidase darf nicht im genetischen Hintergrund aktiv sein
Was ist der Unterschied zwischen β-Galactosidase und β-Glucuronidase?
Um die gewünschte Farbe (indigo) zu erhalten braucht die Galactosidase X-Gal und die Glucuronidase X-Gluc
Was macht Luciferase?
(Ist aus Glühwürmchen)
- emitiert grün-gelbliches Licht
Was ist der Vorteil an Luciferase?
- kann in lebenden Präparaten genutzt werden
- ist sehr gut quantifizierbar
Wie kann man mithilfe von Luciferase feststellen, ob ein bestimmtes Gen kaputt oder mutiert ist?
- durch künstlich zugefügten Stress zB Salzstress und durch selbsten
- > Wenn ein Gen kaputt ist, leuchtet die Pflanze nicht
- > eine Mutation kann u.U. dafür sorgen, dass das Gen dauerhaft exprimiert wird und die Pflanze somit auch ohne Stress dauerhaft leuchtet
Wie kann man sichergehen, ob GFP nicht nur zufällig funktioniert bzw nicht funktioniert?
- immer einmal am C-Terminus und N-Terminus anbauen
- > wenn beide übereinstimmen, sind die Ergebnisse erfolgreich
Was kann man mit den modifizierten GFP-Proteinen YFP, CFP und RFP machen?
- erlauben Co-Lokalisationsuntersuchungen von 2 Proteinen
was bedeutet FRET?
Flourescent resonance energy transfer
Was macht FRET?
Energietransfer zwischen zwei Flourochromen durch:
1. räumliche Nähe der Reportergen-Proteine
- Überlagerung des Emissionsspektrum des GFP mit dem Anregungsspektrum des YFP
Was ist Cameleon?
Ein auf FRET basierender Calcium Indikator
-> Änderung der Ca-Konzentration kann dann sichtbar gemacht werden durch starke Faltung
Was ist das Two-Hybrid System?
System zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen. Der Nachweis geschieht durch die Aktivierung der Transkription von Reportergenen
Was sind die Anwendungen des Two-Hybrid Systems?
- Untersuchung zweier bekannter Proteine auf Interaktion
- Identifizierung unbekannter interagierender Proteine
- Kartierung von Bindungsdomänen
Was sind die Vorteile des Two.Hybrid-Systems?
- Technisch einfach und schnell
- prinzipiell für jeden Organismus, in vivo System
- direkter Zugang zum Gen (cDNA)
- unabhängig von in der Zelle vorliegenden Proteinmenge
- Nachweis schwacher und temporärer Wechselwirkungen
Was sind die Nachteile des Two-Hybrid-Systems?
- nicht jede Interaktion nachweisbar
- false negative: Proteine, die im Organismus interagieren aber nicht in Hefe
- false positive: Proteine, die in Hefe interagieren, aber nicht im Organismus
- zufällig interagierende Proteine und transaktivierende Proteine
Was müsste man tun, um die Ergebnisse gelten zu lassen?
Durch andere Techniken untermauern
Wofür dient das Two-Hybrid-System?
Zum Nachweis Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen
Wozu dient das One-Hybrid-System?
Zur Identifizierung von Unbekannten Proteinen bzw Untersuchung von Proteinen, die an eine bekannte DNA Sequenz binden
Wozu dient das Three-Hybrid System?
Zur Identifizierung von unbekannten Proteinen bzw Untersuchung von bekannten Proteinen, die an eine bekannte RNA-Sequenz binden
