1
Q
MS2 : génome et hôte?
A
Génome d’ARN sb de polarité +, infecte E. coli
2
Q
Où retrouve-t-on le phage MS2?
A
Là où est E. coli : intestins des mammifères, eaux d’égouts
3
Q
On estime que les eaux usées contiennent environ __ phages à ARN/mL
A
10^7
4
Q
Brin positif d’ADN ou ARN vs négatifs?
A
- Brin positif : contient des infos immédiatement traduisibles
- Brin négatif : ARN/ADN complémentaire du brin positif
5
Q
Différence fondamentale entre les virus à ARN et à ADN?
A
- Virus à ADN : synthèse de l’ARNm est faite par l’ARNpol II de l’hôte (enzyme cellulaire)
- Virus à ADN : codent pour leur polymérase d’acide nucléique pour la synthèse de l’ARNm et la réplication du génome, car la ¢ n’a pas de mécanismes pour reconnaître les ARN viraux
6
Q
Classification du phage MS2?
A
- Classe : Leviviricetes (phages d’entérobactéries)
- Famille : Fiersviridae
7
Q
Structure du virion de MS2?
A
- Virions sphériques avec symétrie icosaédrique
- Diamètre : 26 nm
- Capside = 2 protéines → 180 copies de coat et 1 copie de la protéine A
8
Q
Génome du phage MS2? Pour quoi code-t-il?
A
- Génome = molécule d’ARN sb+, 3500 nt
- Génome encore 4 protéines
1. Protéine A
2. Protéine coat
3. Réplicase
4. Protéine de lyse (ORF chevauche coat et réplicase)
***Ce génome (chromosome) = comme un ARNm qui est déjà prêt à être traduit quand il entre dans la cellule
9
Q
Cycle de réplication de MS2?
A
- Phage se fixe à un récepteur et l’ARN viral entre dans la ¢
- Protéines sont traduites à partir du génome d’ARN
- Génome d’ARN est répliqué
- Les virions sont assemblés et quittent la cellule
10
Q
Comment se produit l’attachement et l’entrée de MS2 dans la cellule hôte?
A
- MS2 se lie au pilus F (conjugaison) des entérobactéries
- Virions se fixent sur le côté du pilus (via protéine A)
- Après contact phage-pilus, la protéine A est coupée et l’ARN du phage est libéré dans le cytoplasme de la ¢
11
Q
L’expression des gènes = +++ contrôlée chez MS2. Pourquoi?
A
- Différentes qutés de chaque protéine sont nécessaires
- 180 coat : 1 protéine A : quelques protéines lyse
- 1 réplicase : +++ coat
- La réplication et la traduction simultanées de la même molécule d’ARN = chaos
- Réplication = 3’-5’ de l’ARN vs traduction = 5’-3’ → collision possible entre le ribosome et la polymérase
12
Q
Comment le phage MS2 contrôle la traduction et la réplication simultanées?
A
Limite l’accès du ribosome aux sites d’initiation de la traduction des gènes pendant la réplication
- En modifiant la structure secondaire de l’ARN du génome du phage
13
Q
Phage MS2
Il y a plusieurs codons initiation, mais la structure secondaire de l’ARN permet seulement l’attachement des ribosomes à un seul endroit. Quel site? Permet quoi?
A
- Site en amont du gène codant pour Coat, car coat est la première protéine synthétisée
- Permet de bloquer la réplication jusqu’à ce que la traduction soit terminée
14
Q
Phage MS2
Quand commence la traduction des gènes de lyse et de la réplicase?
A
Quand un ribosome s’est lié au site d’initiation du gène coat et est en cours de traduction → l’avancement du ribosome détache progressivement la structure secondaire, ce qui permet la traduction de la réplicase et des gènes de lyse
- On doit traduire l’ARN pour pouvoir répliquer
15
Q
Phage MS2
Quand la réplicase est produite, elle s’assemblage avec des protéines de l’hôte pour former une polymérase active. Que comprend le complexe de la polymérase?
A
- La réplicase du phage (ARN-pol ARN dépendante)
- Protéine S1 : protéine ribosomale de l’hôte qui se lie aux séquences d’ARNm pendant l’initiation de la traduction
- Facteurs d’élongation de l’hôte : EF-Tu et EF-Ts, impliqués dans l’allongement des chaînes peptidiques en croissance
16
Q
Phage MS2
Comment fonctionne le passage de la traduction à la réplication?
A
- La polymérase se lie en 3’ de l’ARN du phage et à 2 positions internes (S et M) pour commencer la réplication
- Le site S chevauche le début du gène Coat : compétition entre la polymérase et le ribosome pour ce site
17
Q
Réplication de MS2
Que se passe-t-il si la polymérase arrive en premier au site Coat?
A
Pas de traduction : l’ARN polymérase peut synthétiser sans entrave
18
Q
Réplication de MS2
Que se passe-t-il si le ribosome arrive en premier au site Coat?
A
La polymérase ne peut pas se lier à son gabarit = traduction
19
Q
Réplication de MS2
Pendant la réplication, la polymérase s’attache en 3’ de l’ARN et synthétise…?
A
Synthétise un brin d’ARN complémentaire de polarité négative (intermédiaire de réplication = gabarit pour fabrication de nouveaux brins)
20
Q
MS2
Pourquoi les brins complémentaires de polarité + et - ne s’hybrident pas?
A
En raison de la structure secondaire de l’ARN trouvée dans chaque brin unique
21
Q
Phage MS2
Assemblage des virions et lyse cellulaire?
A
- La protéine A se lie à l’ARN = initiation du processus d’assemblage
- Les protéines coat s’assemblent avec l’ARN génomique (autour de la protéine A) pour former les virions
- Les protéines de lyse forment des pores dans la membrane cytoplasmique de la ¢, ce qui permet aux phages de quitter la ¢
22
Q
Caractéristiques du phage lambda?
A
- Infecte E. coli
- Décrit par Lederberg et Lederberg en 1952
- Phage tempéré le ++ étudié, modèle pour étudier des processus de régulation complexes
23
Q
Distribution du phage lambda?
A
- Intestins mammifères, eaux d’égouts
- Échelle mondiale
- Habitats aquatiques!!
24
Q
Classification du phage lambda?
A
Classe : Caudoviricetes
Genre : Lambdavirus
*Pas de famille, genre orphelin
**Avant : famille des Siphoviridae
25
Structure du phage lambda?
- Tête icosaédrique isométrique (diamètre : 55 nm)
- Longue queue flexible non-contractile (150 nm) + fibres
26
Génome du phage lambda?
- ADNdb linéaire, 48 000 pb
- Génome possède de petites extrémités cohésives simple brin (extrémités cos) de 12 nt
- Extrémités sont complémentaires en séquences → permettent au génome de se circulariser dans le cytoplasme
- Code pour 70 gènes (regroupés selon leurs fonctions, coordination de la transcription à partir des mêmes promoteurs)
27
La réplication de Lambda peut être divisée en 2 voies...?
1. Cycle lytique : adsorption, injection, réplication, assemblage et lyse
2. Cycle lysogénique : adsorption, injection, intégration
28
Comment le phage lambda s'attache-t-il à sa cellule cible (E. coli)?
1. Fibres latérales de la queue se lie à OmpC (protéine de la ME)
2. Protéine virale gpJ (extrémité de la queue) se lie à LamB (protéine ME)**
** La seule interaction essentielle
La capside reste attachée à l'extérieur de la cellule après l'infection
29
Comment le phage Lambda fait son entrée dans la cellule suite à son attachement?
- Les protéines (bout de la queue) se réorganisent = facilite passage de l'ADN dans la cellule
- La protéine gpH (protéine étalon de la queue) = injectée dans ¢ → essentielle pour le succès de l'injection de l'ADN
- Extrémités cos se lient = circularisation génome dans le cytoplasme = liaison de façon covalente des extrémités par ADN ligase de l'hôte
30
La transcription du génome lambda est catalysée par quelle enzyme? À quel endroit dans le génome?
Par l'ARNpol dépendante de l'ADN de la cellule hôte
- Aux promoteurs précoces PL et PR
31
À quoi aboutit la transcription par l'ARNpol aux promoteurs PL et PR chez Lambda?
Aboutit à la transcription des gènes N et cro
32
Expression des gènes du phage lambda? cycle lytique
1. Transcription initiée par l'ARNpol de l'hôte
2. Transcription aux promoteurs précoces PL et PR = transcription des gènes N et Cro respectivement
3. La liaison de N à l'ARNpol lui permet d'étendre la transcription à partir du Promoteur L et le promoteur R (transcription dans les deux sens sur le génome)
4. Protéine Cro ↑ sa propre synthèse = synthèse protéine Q = activation de la transcription des gènes tardifs nécessaire pour compléter le cycle lytique (+ en aval)
5. Protéine Q maintient la transcription jusqu'au promoteur PR pour la transcription des gènes tardifs
33
Phage lambda : qu'est-ce que la protéine N?
Facteur d'anti-terminaison de la transcription qui modifie l'ARNpol pour qu'elle demeure liée à travers les terminateurs + gènes précoces (promoteurs PL et PR) → permet à la transcription d'aller + loin, d'être dans les deux sens
34
Comment la protéine Q est synthétisée pour l'expression des gènes de Lambda?
Car la protéine Cro augmente elle-même sa propre synthèse, ce qui augmente la synthèse de la protéine Q.
35
Quels gènes régulent la réplication de l'ADN du phage?
Les gènes précoces O et P (leur transcription est possible grâce à N qui facilite le tout)
36
Transcription des gènes tardifs chez le phage Lambda?
- Débute 10 min après le début de l'infection
- Possible grâce à l'action de la protéine Q qui maintient la transcription jusqu'au promoteur PR
37
Réplication de l'ADN du phage Lambda?
- Par la machinerie de réplication de l'hôte
- Réplication dirigée vers l'origine de réplication du phage par les protéines O et P (gènes précoces)
- Bidirectionnelle initialement; convertie en cercle roulant unidirectionnel
38
Quel est le résultat de la réplication du phage Lambda?
La production de concatémères multi-génomique (plusieurs morceaux de génomes ensemble)
39
Assemblage des virions de Lambda?
- Les têtes et les queues sont assemblées séparément → se rejoignent pour former virions après assemblages indépendants
40
Assemblage de la tête des virions de Lambda?
Procapside vide dans laquelle l'ADN est emballé
- ADN est clivé par une nucléase aux extrémités cos (ce qui libère l'ADN du concatémère)
41
Lyse cellulaire des virions de Lambda?
1. Processus ++ contrôlé qui coïncide avec la formation des phages descendants matures
2. Protéine S105 holine = régulation de la lyse = perfore membrane
3. Protéine R (endolysine) : dégrade couche de peptidoglycane
4. Protéines Rz et Rz1 = formation du complexe spannin = perturbe ME = phage sont libérés de la cellule
42
Quand a lieu la lyse cellulaire par les virions du phage Lambda?
Quand les concentrations de la protéine S105 holine sont ++ élevées, la protéine perfore la membrane cellulaire
43
Comment est régulé le cycle lysogénique du phage Lambda?
Par la protéine cII : choix cycle lytique ou lysogénique
- cII active le promoteur PRE (transcrit vers la gauche = lysogénie)
- Quand cII ↑ (plus de cro), la transcription du gène Int (intégrase) ↑ = intégration du génome du phage dans le chromosome (lysogénie)
44
Comment se fait l'intégration du phage Lambda dans le chromosome de l'hôte?
- Au site de fixation att : endroit dans le chromosome qui ne perturbe pas la cellule hôte
- Un prophage est formé par une recombinaison site-spécifique entre le site d'attachement du phage (attP) et le site bactérie (attB)
- Recombinase est catalysée par l'intégrase (Int) + facteur d'intégration de l'hôte : IHF
45
À la suite de l'intégration du prophage de lambda dans l'hôte, comment est le génome du phage?
Il devient linéaire
46
Phage Lambda :
La protéine cII code pour une intégrase, mais aussi autre chose. Quoi?
Permet la transcription du gène cI qui code pour la "protéine répresseur lambda" → elle réprime la transcription de TOUS les gènes sauf les siens = régulation du cycle lysogénique
47
Rôle de la protéine répresseur lambda dans la régulation du cycle lysogénique?
Permet la transcription de cI (car elle active son propre promoteur PRM), tout en inhibant PL et PR
48
Phage Lambda :
cII est protégée par la protéine ___ (produite en même temps qu'elle) mais aussi dégradée par l'enzyme de l'hôte ____.
- Protégée par la protéine cIII
- Dégradée par l'enzyme HflB
49
Une forte concentration de ___ est nécessaire pour initier et conserver la lysogénie.
cII
50
Si cII n'est pas assez protégée par cIII de la dégradation, la protéine cro ↑. Conséquence?
Cro inhibe la transcription de cIII et cI, ce qui ↓ ++ la quantité de cII et du "répresseur lambda".
- Faible concentration de "répresseur lambda" = transcription de xis, int et cro.
- Xis = excisionase qui redirige l'intégrase pour recréer les sites attP et attB = libération prophage
51
Que se passe-t-il quand la synthèse du "répresseur lambda" est complètement cessée?
Protéine Q ↑ et les gènes nécessaires pour terminer la voie lytique sont activés
52
Dans quelles conditions se produit l'induction du phage Lambda?
En réponse à des facteurs environnementaux : mutagènes chimiques, UV...
53
Phage Lambda :
Quand l'ADN de l'hôte est endommagée, l'enzyme de réparation ____ est produite. Son rôle dans l'induction du phage?
RecA
- Incite le répresseur lambda à se cliver = transcription de cI = ↓ répresseur lambda
54
Phage lambda :
Que se passe-t-il si la concentration du répresseur lambda est plus grande que celle de la protéine cro?
- Intégration du génome du phage dans l'ADN de l'hôte = production ++ répresseur lambda
- Inhibition de l'expression des gènes lytiques, réplication du phage en tant que partie du génome de l'hôte et maintenance de la lysogénie
- Stress facteurs environnementaux
- cI est inhibée par cro, ce qui mène à l'expression des gènes lytiques (protéine Q) = réplication de l'ADN = production de virions
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