GC-principen - Gaskromatografi
- Flyktiga analyter eluerar först
- Analytens interaktion med stationära fasen påverkar retentionstiden.
- Låg interaktion = låg retention.
Instrumentering för Gaskromatograf
- Carrier gas: Innehåller gasen som kontinuerligt kommer att flöda genom kolonnen och hela systemet. Reagerar inte med någonting och består ofta av helium eller kvävgas.
- Gas behållaren är kopplad till en flödes kontrollerar, med den kan man bestämma hur snabbt gasflödet är genom att vrida på den
- Injektionsporten: Där man injicerar provet för hand med en spruta och provet är i gas eller vätskefas i kapillär kolonnen.
- Injektionsporten sitter i en ugn så att man kan kontrollera temperaturen av provet så att analyterna omvandlas till gas form.
- Kapillär kolonnen: Som innehåller provet som finns antingen i gas eller vätskeform. Den är ett långt rör med en liten diameter men är 20-40m på längd. För att få plats med den i ugnen så rullar man ihop kapillär kolonnen.
- Detektor: Detekterar de analyterna som lämnar kapillär kolonnen och hur intensiva toppar analyterna ger upphov till
- Detektorn är kopplad till en dator som ger oss ett kromatogram från signalerna där retentions tid är på x axeln och på y axeln har vi intensiteten.
Typer av GC - injektion
- Split injektion förs endast ungefär 1 % av provet från provkammaren in i kolonnen. Resten av provet överförs till slasken. Split injektion är den vanligaste injektionsformen då prover ofta innehåller för hög koncentration av analyterna.
- I splitless injektion förs hela provet in i kolonnen. Detta används endast om koncentrationen av analyt i provet är väldigt låg (<0,01 %)
Varför används Intern standard inom GC? Definition samt princip?
- För att utjämna variationer mellan olika experiment. eftersom genom att man injicerar provet för hand så är det svårt att få likadana prover)
Definition: Att man tillsätter en substans i ett prov i känd koncentration för att underlätta den kvalitativa identifieringen eller den kvantitativa bestämningen.
Princip:
* Signalen från provet jämförs med den interna standarden.
* Intern standard är önskvärt då provförlust kan ske vid provupparbetning eller då instrument-responsen varierar från prov till prov.
* Man väljer en substans med så lika egenskaper som provet som möjligt. Vid MS-detektion används ofta deutererad internstandard.
Vilka två faser består Gaskromatografi (GC) av?
- Stationär fas: Oftast en vätskefas med hög kokpunkt som är fäst på insidan av kolonnen.
- Mobil fas: gas t ex H2, He, N2
- Detektor: t ex FID eller MS.
Vilken är den viktigaste faktorn som avgör retentionen?
Den viktigaste faktorn som avgör retentionen är hur pass flyktig analyten är. Ju högre flyktighet desto lättare får vi analyten till gasform och då passerar den snabbare genomkolonnen via den mobila fasen som är då en gas. Till en grad sker separationen även beroende på interaktion med stationära fasen.
Exempel på detektorer (GC) och dess för- och nackdelar
FID:
Fördelar: Generell, Stort linjärt område
Nackdelar: Moderat känslighet (0,1-10 ng)
NPD:
Fördelar: Selektiv, Hög känslighet (1-10 pg)
Nackdelar: Kräver analyt med N eller P
Kräver noggrann kontroll av He, H2, O2 (Kritiskt för selektiviteten för P och N)
MS:
Fördelar: Hög selektivitet, Hög känslighet
Nackdelar: Dyr
ECD:
Fördelar: Selektiv, Hög känslighet ( 0,1 - 100 pg)
Nackdelar: Kräver elektronegativa grupper
Reglering av retention hos GC
- Temperaturen av injektor, kolonnen och detektorn: Ökad temperatur innebär minskad retention
- Olika gaser kan röra sig olika snabbt.
- Typ och mängd av stationära fasen: En opolär analyt kommer att kunna interagera bättre med en opolär stationär fas. Har vi mer stationär fas coated så kommer vi att ha fler bindings sights för analyten
- Hur lång kapillären är och dess diametern
Derivatisering av analyt (GC)
Derivatisering: Innebär att minska polaritet och öka flyktighet hos analyten genom att införa polära grupper med en silyl grupp (kisel) eller en metyl grupp och gör de mer flyktiga → mindre polära)
- Detta förbättrar den termiska stabiliteten hos analyten, annars kan de brännas upp
- Den öker känsligheten genom att införa funktionella grupper som ger en högre detektorsignal.
- Detta förbättrar prov topparnas utseende
För- och nackdelar med GC
Fördelar:
- Många olika typer av detektorer med hög selektivitet och bra känslighet
- Hög effektivitet (N), tack vare många teoretiska bottnar i och med att de är så långa och har en smal diameter.
- Ofta snabbare separationer än HPLC (Med tanke på att mobilfasen är en gas alltså lättare att pumpa gas genom kolonnen än en vätska)
- Liten injektionsvolym (0.5-2.0 μL) (Små volymer av provet pga en liten diameter)
Nackdelar
- Analyterna måste vara flyktiga och termostabila för att kunna omvandlas till gasform annars så kräver de ofta derivatisering av analyten.
- Svårt att injicera samma mängd prov varje gång
Skillnader mellan GC och LC (Vätskekromatografi)
Fördelar med GC
- Många olika detektorer att välja bland med hög selektivitet och bra känslighet
- Ofta snabbare separationer än i LC (Lättare att pumpa gas genom kolonnen)
- Lättare att koppla till MS än LC eftersom ämnena redan befinner sig i gasform
Fördelar med LC
- Analyserna sker vid rumstemperatur, vilket minskar problemen med termisk nedbrytning
- Med LC kan även oflyktiga ämnen analyseras
- Mobilfasens sammansättning kan varieras för att styra separationen
- Injektionsvolym är mer reproducerbar
Kapillär Elektrofores
- Är en separations teknik som bygger på vandring av elektriskt laddade molekyler eller partiklar i en vätska under inverkan av ett elektriskt fält.
- Består av en anod på ena sidan av elektriska fältet och en katod i den andra änden
- Här krävs det att analyten är laddad för att kunna analyseras med elektrofores
Principerna bakom elektrofores (CE)
- Till skillnad från i kromatografi:
Vi har inte två faser i en elektroforetisk uppställning utan enbart EN lösning.
Ett pålagt elektriskt fält mellan två elektroder, anod och katod som möjliggör vandring av analyt molekylerna - I kapillär elektrofores (CE) tillförs provlösningen till anoden som är förbunden till katoden med en kapillär. En detektor detekterar sedan när analyt molekylerna passerar.
- Separation i elektrofores grundar sig på att analyter vandrar olika snabbt i ett pålagt elektriskt fält i tre steg:
1) Provlösningen kopplas till en spänningsaggregat
2) Beroende på laddning och storlek (massa) kommer analyterna i provet vandra olika snabbt (Små analyter rör sig snabbare)
3) Ju längre silika kapillärern är, desto längre sträcka, och därmed tid, har analyterna att vandra, och därmed separerar de i högre utsträckning, och avståndet mellan dem ökar, där resolutionen också ökar
Kapillärelektrofores (CE) – Instrument
Kapillären:
- Är oftast av kisel.
- OH kommer att få deras laddning beroende på pH värdet av omgivningen (Vid höga pH värden kan de deprotoneras och vara laddade)
- Oftast 50 – 75 μm innerdiameter
- Längd: från ca 20 cm, 50 – 70 cm vanligt
Spänningskällan:
- 5.000-30.000 V, alltså betydligt högre än andra elektroforesmetoder.
Elektrokinetisk injektion
Detektor
Elektroforetisk vandringshastighet (CE)
Jonens mobilitet beror av dess storlek och laddning
- Ju högre laddningsgrad desto högre attraktion av pol med motsatt laddning
- Ju mindre jon desto högre hastighet
Elektroosmos
- Transport av analyter i kapillärelektrofores (CE) beror på den pålagda spänningen (Elektroosmosen)
- INTE på trycket (Jämfört med t.ex. LC, där analyten pumpas). Detta ger en annan flödesprofil än t.ex. kromatografi
Reglering av elektroosmosen
- Ändring av pH: en ökning av pH ger ökad elektroosmos p.g.a. fler joniserade silanol grupper
Vid högre pH är en större del av silanol grupperna deprotonerade → fler katjoner kan interagera med de negativt laddade silanol grupper. När elektriska fältet är på då drar den med sig vattenmolekyler till katoden - Jonstyrka: En ökning av jonstyrkan ger en mindre aktivitet för jonerna som ger en mindre elektroosmos
- Kemisk modifiering: Kemisk modifiering av kapillärens yta kan göra den oladdad (Som minskar elektroosmosen) eller positiv (Som ger omvänd elektroosmos)
Jämförelse mellan CE och LC
Fördelar med CE
* Högre effektivitet (N) jämfört med LC (Fler antal teoretiska bottnar och mindre bandbreddning)
* Flera storleksordningar mindre injektionsvolymer (nL i CE jämfört med μL i LC)
Fördelar med LC
* Kan mäta lägre koncentrationer (p.g.a. större detektionsvolym)
* Kan även separera oladdade analytmolekyler
* Bra för upprening av stora mängder substans
