Techniken - Blots

Question 1

Blots

Answer 1

• Southern Blot, Northern Blot:
  Detektion bestimmter Nukleinsäurefragmente
  Probe: Gemisch von Nukleinsäurefragmenten
  Sonde: einzelsträngige DNA oder RNA, komplementär zur Sequenz des gesuchten Fragments
• Western Blot:
  Detektion von Proteinen
  Probe: Proteinmischung
  Sonde: Antikörper, diese binden nur an das gesuchte Protein

Question 2

Southern Blot für DNA

Answer 2

• 1975
  • DNA ggf. in Stücke schneiden
  • Gemisch mit Gel auftrennen (Agarose, Acrylamid)
  • denaturieren: DNA wird einzelsträngig
  • blotten: DNA auf Membran übertragen
  (Kapillarblot, Elektroblot)
  • blocken: Sonde kann nur an DNA binden,
  nicht an Membran ( unspezifische Bindestellen maskieren)
  • hybridisieren: Sonde = markierte ssDNA
  (radioaktiv, DIG, Biotin/Streptavidin)
  • waschen: ungebundene Sonden entfernen
  • Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbreaktion
  ABBILDUNG

Question 3

Northern Blot für RNA

Answer 3

• 1977 James Alwin, James Kemp, George Stark
  • Probe: z.B. alle mRNA einer Zelle
  • Gemisch mit Gel auftrennen (denaturierende Gele)
  • blotten: RNA auf Membran übertragen (Kapillarblot, Elektroblot)
  • blocken: Sonde kann nur an RNA binden, nicht an Membran
  • hybridisieren: Sonde = markierte ssDNA oder ssRNA
  (meist radioaktiv)
  • waschen: ungebundene Sonden entfernen
  • Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbreaktion

Question 4

Western Blot für Proteine

Answer 4

• 1979 Robert Nowinski, W. Neal Burnette, Harry Towbin
  • Probe: z.B. alle Proteine einer Zelle
  • Gemisch mit Gel auftrennen (SDS-PAGE)
  • blotten: Proteine auf Membran übertragen
  (Kapillarblot, Elektroblot)
  • blocken: Sonde kann nur an gesuchtes Protein binden, nicht an Membran
  • Immundetektion: Sonde = markierte, spezifische
  Antikörper (radioaktiv oder enzymatisch)
  • waschen: ungebundene Antikörper entfernen
  • Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbrektion

Question 5

Übersicht

Answer 5

• Southern: DNA & ssDNA
• Northern: mRNA, ssDNA oder ssRNA
• Western: Protein & Antikörper