Les différentes classes de cellules immunitaires impliquées dans la réponse humorale sont retrouvées surtout au niveau des …
organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions lymphatiques)
Quoi faire afin d’éliminer les érythrocytes de la rate?
on procède à une lyse des globules rouges avec une solution ACK ou de red lysis buffer. La solution ACK et une solution d’Ammonium-Chloride-Potassium qui permet d’éliminer les globules rouges sans affecter les globules blancs.
*Pour les ganglions lymphotiques, il n’y a pas de globules rouges.
Comment différencier les lymphocytes?
Une fois les lymphocytes isolés de la suspension cellulaire de la rate, il est possible de les différencier grâce aux glycoprotéines spécifiques qu’ils portent à leur surface.
Des anticorps monoclonaux spécifiques à ces glycoprotéines et couplés à des fluorochromes seront utilisés en cytométrie en flux, permettant ainsi de déterminer les proportions de chacune des populations de cellules lymphoïdes de la rate.
Que renseigne FSC vs SSC dans la cytométrie e flux?
En traversant le faisceau, la cellule diffuse et réfracte la lumière, ce qui nous renseigne sur sa taille (FSC) et sa granularité (SSC), respectivement.
À quoi sert un contrôle négatif dans la cytométrie en flux (unstained cells)?
Afin de distinguer l’auto-fluorescence de la fluorescence attribuée aux fluorochromes, on s’assure d’avoir un contrôle de cellules non-marquées, ce qui détermine le bruit de fond, exclusivement attribué à la fluorescence naturelle.
À quoi sert un hématimètre?
On dénombre les cellules contenues dans une solution à l’aide d’un hématimètre,
i.e. une lame de verre épaisse portant, gravé à sa surface, des carrés de dimensions précises d’une hauteur de 0,1 mm (la chambre à compter). Chaque hématimètre possède deux chambres à compter.
L’énumération de cellules nucléées est effectuée en utilisant quel colorant?
le bleu de trypan.
Que va colorer le bleu de trypan?
Ce colorant imperméable n’est pas internalisé par les cellules vivantes, mais les cellules mortes (perméables) peuvent l’internaliser. Il s’agit d’un colorant toxique pour les cellules : il faut donc procéder assez rapidement pour ne pas induire de mortalité cellulaire et ainsi fausser l’énumération cellulaire.
Formule comptage de cellules avec hématimètre.
Formule : Nombre de cellules X (dilution dans bleu de trypan) X 10 000.
*Pour la dilution, si votre dilution était 1 :10, vous devez mettre le nombre 10 pour la dilution dans bleu de trypan. Cependant, si votre dilution était de 1 :5, vous devez mettre le nombre 5 pour la dilution dans bleu de trypan.
—> La formule donne la concentration => nombre de cellules/mL, si on veut la quantité totale on doit multiplier par le volume de l’échantillon
Quel va être le marquage pour les cellules T naïves vs activées vs mémoires?
CD4, CD8, CD44, CD62L et TCR
Permettra de déterminer les cellules T naïves (CD44 négative et CD62L hi), activées (CD44 hi et CD62L low, et mémoires (CD44 mid et CD62L hi)
- TCR+
Que permet la technique ELISA?
La technique ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) est une technique immunoenzymatique qui permet la détection et le dosage des antigènes ou des anticorps présents dans une solution.
Comment est adsorbé l’antigène dans l’ELISA?
On adsorbe l’antigène à une concentration connue dans le fond de la plaque qui servira à l’ELISA. L’antigène se fixera au plastique en fonction du pH, des forces électrostatiques et surtout, des forces hydrophobes.
Expliquer comment faire un ELISA (5 étapes)
- Adsorption de l’antigène sur le support : on adsorbe une quantité connue de l’antigène utilisé pour l’immunisation sur une plaque 96 puits. Les protéines se lient au polystyrène de façon non-covalente et pH-dépendante. Les protéines non fixées au support sont ensuite lavées.
- Blocage des sites résiduels : afin d’empêcher que les anticorps se fixent au support de façon non-spécifique, on bloque les sites résiduels avec une protéine (élimination du « bruit de fond »).
- Échantillons de sérum : les anticorps spécifiques à l’antigène utilisé, présents dans l’antisérum de souris, se fixent de façon spécifique à l’antigène adsorbé au support. Les anticorps non fixés sont ensuite éliminés par l’étape de lavage.
- Anticorps secondaires : des anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase de raifort, une enzyme, sont ajoutés aux puits. Ces anticorps se fixent aux anticorps de l’antisérum de souris fixés aux antigènes adsorbés au support. Les anticorps secondaires non-fixés sont éliminés par l’étape de lavage.
- Révélation : le chromogène utilisé dans ce test est le dihydrochloride o‑phénylènediamine (OPD), lequel est ajouté aux puits avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2), le substrat de l’enzyme conjuguée aux anticorps secondaires. Lorsque le H2O2 et la peroxydase de raifort réagissent ensemble, l’OPD s’oxyde, ce qui entraîne la coloration jaune du puits. L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration d’anticorps dans le puits. Une fois la réaction chromogénique arrêtée avec l’acide sulfurique (H2SO4) 2M, l’intensité de coloration peut être lue au spectrophotomètre à 492 nm.
Qu’est-ce qui compose le chromogène de l’ELISA?
OPD + tampon citrate
Qu’est-ce qui cause l’apparition de couleur dans les puits de l’ELISA?
L’enzyme conjuguée à l’anticorps secondaire cause l’oxydation du chromogène, faisant apparaître de la couleur.
Lorsque le H2O2 et la peroxydase de raifort réagissent ensemble, l’OPD s’oxyde, ce qui entraîne la coloration jaune du puits.
Réaction positive
Que représente le blanc dans l’ELISA?
Toute absorbance mesurée dans le blanc représente le bruit de fond qui ne doit pas être considéré comme une réaction positive, puisqu’elle ne résulte pas de la réaction substrat-enzyme spécifique à la fixation de l’antigène adsorbé sur le support.
Comment déterminer un titre?
L’Inverse de la plus grande dilution qui a donné une réaction positive
Qu’est-ce que l’électrophorèse?
L’électrophorèse fait référence à la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique.
En fonction de quoi migrent les protéines dans un SDS-PAGE?
Puisqu’on utilise une matrice de migration non-homogène (le gel de polyacrylamide) et qu’on homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution, celles-ci migreront dans le gel en fonction de leur poids moléculaire.
La polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide est initiée par quoi (2)?
des catalyseurs, soit le persulfate d’ammonium (APS) et le TEMED.
Les radicaux libres du APS catalysent la polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide, tandis que le TEMED accélère le taux de formation de radicaux libres du APS.
Plus le pourcentage de polyacrylamide est élevé, plus la migration des protéines se fera de façon …
Précise —> plus détaillée
La mobilité relative (Rf) des protéines dans le gel est ______________ au logarithme de leur poids moléculaire (Mr).
inversement proportionnelle
Que permet SDS?
puissant dénaturant de protéines. Il s’agit d’un détergent anionique qui permet, d’une part, de solubiliser les protéines de l’échantillon, et d’autre part, d’appliquer une charge négative constante par unité de masse, en s’enrobant autour de la structure du polypeptide.
Quels sont les gels présents dans la méthode Laemmi (2)?
On coule un gel de compactage au-dessus du gel de séparation, ce qui permet à l’échantillon de se compacter et se concentrer avant de pénétrer dans le gel de séparation, ce qui améliore ensuite la résolution et la séparation des polypeptides lors de la migration.
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Immunité innée96
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Immunité spécifique74
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CMH52
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Récepteurs et molécules membranaires accessoires112
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Sélection positive et négative85
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Cours 149
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Cours 249
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Cours 357
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Cours 429
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Cours 627
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Cours 714
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Sélection positive et négative des cellules T45
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Initiation de la réponse T et cytokines6
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Réponses effectrices à médiation cellulaire0
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Réponses cytotoxiques0
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TP39
