Unterschied Eu/Pro im Bezu auf Translation
- die Ribosomen sind größer und langlebiger in Bakterien
- Eukaryoten benutzen normales Methionin, kein f-Met, als erste Aminosäure
- Transkription und Zranslation sind zeitlich und räumlich getrennt
- Das 5’-Ende der mRna wird mit einer methylierten Guanin versiegelt
- An das 3’-Ende wird ein Poly-A-Schwnaz angehangen
- Translation in Eukaryoten benötigen generell mehr Faktoren bzgl. Initiation, Elongation und Termination
.Viele Ribosomen sind nicht freischwimmend imCytoplasma wie bei Bakterien, sondern in der Membran des ER eingebettet
Was ist die Kozak-Sequenz
Viele eukaryotische mRNAs besitzen eine Purinbase drei Basen vor dem Startcodon,
Die Base nach dem Startcodon ist ein G
A/G NN AUG G
->Es wird vermutet, dass die Kozak-Sequenz die Effizienz der Translation durch Interaktion mit der initialen tRNA verbessert
Versuch Beadle/Tatum
Test was die ene Mutation auslöst
mutierter Stamm wächst nicht auf Minimalmedium
->etwas fehlt aber was
mutierter Stamm wächst auf minimal + Aminomedium
->eine Aminosäure kann nicht mehr hergestellt werden
->welche
mutierter Stamm wächt auf Minimal + eine spezielle AS
->bestimmte As fehlt
–>diese Gen ist kaputt
bewiesen: Ein-Gen:Ein-Enzym-Hypothese
Ein-Gen: Ein-Polypeptid
Ein-Gen: Ein-Enzym-Hypothese stiimt nicht ganz weil
- > die meisen nicht alle Enzyme sind Proteine
- > viele Proteine besitzen mehr als eine Untereinheit
- > Verfeinerung zur ein Gen: eine Polypeptidkette
Proteinfaltung
von den Ribosomen werden aneinandergereihte AS entlassen, die Polypeptidketten bilden
- > Nach der Translation falten falten sich die Polypeptidketten in höher geordnete Strukturen und können mit anderen Polypeptidketten interagieren
- > die dreidimensionale Struktur eines Proteins ist essentiell für dessen Funktion
Es gibt drei Proteinstrukturen Primärstruktur Sekundärstruktur Tertiärstruktur Quartärstruktur
dreidimensionale Struktur hängt ab von der Aminosäuresequenz (Primärstruktur) des Proteins
Posttranslationale Modifikationen
Entfernung oder Modifikation des N-Terminus
Komplexierung mit Metallionen
Kohlenhydrathseitenketten werden angehangen
Was sind Proteindomänen
oft sind bestimmte Regionen von Proteine, also eine bestimmte Folge von Aminosäuren, mit speziellen Funktiion der Proteine assoziiert
diese Sequenzen bilden Proteindomänen
- Proteindomänen falten sich in stabile und spezifische Strukturen auf
- verschiedene Proteindomänen verleihen verschiedene funktionelle Fähigkeiten
Exon shuffling
ist ein Prozess, die den verschiedene Exons in einem Gen unterschiedlich zusammengesetzt werden, um eine neue Exon-Struktur zu generieren
- Exons können verdoppelt werden
- vermutlich verantwortlich für die Kodierung von Proteindomänen
- könne evolutionär so sein, dass die Bildung einzigartiger Gene bei Eukaryoten gewährleistet wird
Rekombinante DNA
Allgemein
verbundene DNA-Moleküle, die aus unterschiedlichen biologischen Quellen kommen und in der Natur nicht verbunden vorkommen
Rekomimamte DNA
Schritte zur Erstellung
- Generierung spezifischer DNA-Fragmente mithilfe von Restriktionsenzymen
- Fragmenete und Vektoren mithilfe einer Ligase verbinden
- Transfer der rekombininanten DNA-Molekülen in Wirtszelle
- >Erzeugung vieler Kopien
Restriktionsenzyme
- Enzyme, die an eine spezifische (häufig palindromische) Sequenz innerhalb der DNA binden und dort schneiden können
- > Erzeugung von sticky/cohesive oder blunt end
Palindrom: Zeichenkette, die vorwärts und rückwärts dasseöbe ergibt
Welches Enzym kann DNA verbinden
DNA-Ligase
Vektoren
Trägermoleküle der DNA, die geklonte DNA-Fragmente in einer Wirtszelle replizieren können
- > Vektoren müssen sich selbstständig replizieren können und sollten mehrere Schnittstellen für Restirktionsenzyme beinhalten, sodass DNA-Fragmente eingefügt werden können
- > Vektoren sollten einen selektierbaren Genmarker enthalten, sodass man Wirtszellen, die den Vektoren aufgenommen haben von anderen unterscheiden kann
Plasmide
extrachromosomale, doppelsträngige DNA in Bakterien/Archaeen, die sich unabhängig vom Hauptchromosom replizieren
Modifizierung für DNA-Klonierung
- > mehrere Schnittstellen für Restriktionsenzyme
- > Markergen
Blau-Weiß-Selektion
- > wird genutzt um zu unterscheiden ob Zelle Vektor aufgenommen hat
- > Vektor wird eingebaut in LacZ-Gen und dieses verleirt dadurch seine Funktion
- > alle Bakterien die weiß bleiben, weil sie Lactose nciht verstoffwechseln (sobst blauer Farbstoff) haben Vektor aufgenommen
Phagen als Vektoren
lambda phage
->bis zu 45 kb von geklonter DNA
BACs
Bacterial artificial chromosoms
bis zu 100 kb fremde DNA-Sequenzen
->normalerweise geringe Anzahl an Kopien
Wie können Pflanzenzellen transformiert werden?
Riziobium radiobacter kann genutzt werden, um Pflanzenzellen mit T-DNA, die fremde DNA enthält, zu transformieren
Rhizobium enthält Ti-Plasmid (tumor inducing), welches tumorinduzierende Gene enthält
- > Die tumorinduzierenden Gene können vom Vektor entfernt werden, sodass der rekombinante Vektor keine Tumorbildung enthält
- > Wenn der Vektor mit der Pflanzenzelle vermischt wird, dringt in die Zelle ein und die fremde DNA wird vom Pflanzengenom inseriert
- > Die Pflanzenzellen können in einer Gewebekultur gezüchtet werden und man kann sogar eine ganze Pflanze regenerieren, die ein fremdes Gen enthält
Wie wird cDNA erstellt und wofür wird sie genutzt?
erstellt
- Isolation von mRNA von Zellen
- Synthese der komplementären DNA durch reverse Transkriptase
- Einbau in Vektor
cDNA-Bibliothek
gibt Ausschluss darüber, wie viele und welche Gene in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv sind
->hilft dabei, wichtige einzelne Gene in speziellen Gewebetypen zu isolieren
“Library screening”
-> durchsuchung nach einem bestimmten Gen durch Sonde
PCR
- Denaturierung DNA (92-95)
- Anbringen eines Primers (45-65)
- Extend primers (65-75)
->Wiederholung
Sounthern Blot
zur Identifizierung welche Klone in einer Bibliohek beinhalten die gegebene DNA-Sequenz
Sanger DNA Sequenzeirung
Fluorenzenzmarkeirente Dideoxynucleotide (ddNTPs) terminieren die Elongation von DNA während der PCR
Fluoreszenz der Sonde gibt Hinweise auf die letzte ersetzte Base
