Qu’est-ce que la fluorescence ?
Émission de photons suite à l’absorption d’énergie lumineuse.
La fluorescence peut être causée par l’activation enzymatique, la chimio-luminescence, ou la photoluminescence.
Quels types de molécules sont capables d’émettre de la fluorescence ?
Fluorophores ou fluorochromes.
Certaines molécules industrielles comme le bromure d’éthidium sont également utilisées pour détecter des acides nucléiques.
Qu’est-ce que l’auto-fluorescence ?
Fluorescence naturelle dans des tissus due à la présence de molécules fluorescentes endogènes.
Exemples : acides aminés, NADH, bases azotées.
Quel est le phénomène de la fluorescence ?
Émission d’un photon durant la transition électronique d’un état excité S1 à l’état fondamental S0.
La molécule reste dans l’état excité pendant quelques nanosecondes avant d’émettre un photon.
Qu’est-ce que la loi de Stokes ?
L’énergie portée par un photon est inversement proportionnelle à sa longueur d’onde.
Cela signifie que λ excitation < λ émission.
Qu’est-ce que le spectre d’excitation d’un fluorophore ?
Le spectre représentant les longueurs d’onde absorbées par le fluorophore.
Chaque fluorophore a un spectre d’excitation (exc) et un spectre d’émission (em).
Qu’est-ce que le photoblanchiment ?
Perte graduelle de fluorescence avec le temps, due à la dégradation irréversible du fluorophore.
Utilisé en FRAP pour étudier la diffusion et la mobilité des molécules.
Qu’est-ce que le FRAP ?
Fluorescence Recovery After Photobleaching, une technique pour mesurer la mobilité des molécules marquées par fluorescence.
Elle implique l’observation de la récupération de la fluorescence après un blanchiment localisé.
Qu’est-ce que la durée de vie de la fluorescence (τ) ?
Temps moyen qu’une molécule reste dans son état électronique excité avant de retourner à l’état fondamental.
Utilisée dans la technique FLIM.
Quels types de microscopes sont utilisés pour la fluorescence ?
Microscopes à fluorescence, épifluorescence, confocal, bi-photon, vidéo-microscopie.
Chaque type de microscope a des applications spécifiques et des caractéristiques uniques.
À quoi sert un biosenseur fluorescent ?
Pour le monitoring spatio-temporel des molécules et de l’activité enzymatique dans des tissus vivants.
Les biosenseurs peuvent être chimiques ou basés sur des protéines.
Qu’est-ce qu’un capteur non ratiométrique ?
Un capteur avec une longueur d’onde d’excitation et une longueur d’onde d’émission.
Exemple : Fluo-4, qui détecte le calcium intracellulaire.
Qu’est-ce qu’un capteur ratiométrique ?
Un capteur avec une longueur d’onde d’excitation et plusieurs longueurs d’onde d’émission pour mesurer le rapport entre elles.
Exemple : Indo-1, qui mesure les variations de calcium intracellulaire.
Qu’est-ce que le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) ?
Transfert d’énergie non radiatif entre un donneur et un accepteur.
Utilisé pour détecter les interactions entre protéines.
Qu’est-ce que le FRET ?
Transfert d’énergie non radiatif entre un donneur et un accepteur
FRET signifie ‘Förster Resonance Energy Transfer’, du nom du physicien Theodor Förster.
Quel est le principe de fonctionnement du FRET ?
Transfert d’énergie par résonance entre un fluorophore donneur et un accepteur
Le transfert d’énergie est non radiatif, ce qui signifie que l’énergie est transférée sans émission de photons.
Qu’est-ce qu’un capteur dans le contexte du FRET ?
Protéine chimérique avec un domaine capteur fusionné à 2 protéines fluorescentes
Comment ajouter une seconde protéine pour le FRET ?
Ajouter une seconde protéine Yfp
Yfp agit comme accepteur, tandis que CFP est le donneur.
Que se passe-t-il lorsque le donneur est excité en présence de FRET ?
L’intensité lumineuse émise par le donneur diminue et l’accepteur émet de la lumière
Cela est dû au transfert d’énergie du donneur à l’accepteur.
Quelles sont les conditions pour que le FRET se produise ?
- Le spectre d’émission du donneur doit chevaucher celui d’excitation de l’accepteur
- Les deux fluorophores doivent être proches, à moins de 10 nm
- L’orientation des deux protéines fluorescentes doit être différente de 90 degrés
Que signifie un rapport Facceptor/Fdonnor élevé ?
Indique une augmentation de Ca2+ dans la cellule
Cela est utilisé pour étudier les interactions moléculaires.
Que se passe-t-il lorsque le Ca2+ se lie au capteur ?
L’intensité lumineuse émise à 480 nm diminue et celle à 530 nm augmente
Quel est l’effet de l’augmentation de calcium sur les cellules exprimant des donneurs et des accepteurs ?
Diminution de la fluorescence globale du donneur et augmentation de celle de l’accepteur
Quel est le rôle des capteurs ratiométriques ?
Éliminent les artefacts observés avec des capteurs à émission unique et augmentent mathématiquement l’amplitude de réponse
