Vl 2 Gimpl: Response Elements und Transkriptionsfaktoren

Question 1

Was sind Transkriptionsfaktoren?

Answer 1

• Proteine, die an Promoter, Enhancer, oder Response Elements binden und die Transkription aktivieren oder reprimieren.
• Trans-aktivierende Elemente, die meistens an spezifische DNA Sequenzen binden.

Question 2

Was heißt trans-aktivierend?

Answer 2

trans-acting factors entfalten ihre Wirkung weit entfernt von der Lage ihres eigenen Gens

Question 3

Was versteht man unter cis- regulatorischen Elementen?

Answer 3

• Regulatorische Sequenzmotive in Promotoren von Genen, die zu deren Transkription benötigt werden und mit trans acting elements interagieren.
• Liegen in unmittelbarer Nachbarschaft zum codierenden Bereich und ergänzen den so genannten Minimalpromotor (Corepromotor).

Question 4

Welche vier Motive erkennen Transkriptionsfaktoren?

Answer 4

Strukturmotive in Transkriptionsfaktoren
1. Helix-turn-Helix Motive (DNA-Bindungsdomäne)
2. Zinkfinger-Motive (DNA-Bindungsdomäne)
3. Leucin-Zipper-Motive (Oligomerisierungsdomäne)
4. Helix-Loop-Helix-Motive (Oligomerisierungsdomäne)

Question 5

Wie sehen Helix-turn-Helix Motive aus?

Answer 5

• Sequenzspezifische Erkennung in der großen Furche, es gibt Erkennungs- und Fixierungsdomänen.
• Dimere binden 2 aufeinander folgende große Furchen.

Question 6

Wie sehen Zinkfinger-Motive aus?
Wo kommen sie vor?

Answer 6

• Beta-Faltblatt über Zink-Ion mit Alpha Helix verknüpft
• Häufig sind 2 Cys (Beta-Faltblatt) und 2 His (alpha-Helix) an Zink komplexiert,
  z.B. in Zinkfingernucleasen oder Glucocorticoid-Rezeptoren.

Question 7

Wie sehen Leucin-Zipper-Motive aus?

Answer 7

• Leucin-Zipper bestehen aus α-helikalen Regionen, bei denen ca. jede 1. und 4. aus 7 AS (meist Leucin) hydrophob ist.
• Alle Leucine befinden sich dabei auf einer Seite der Helix, sodass ihre hydrophoben Reste in die gleiche Richtung weisen.
• Die langen Seitenketten der Leucinreste assoziieren über hydrophobe Wechselwirkungen mit den Leucinresten einer anderen Helix, sodass sich Dimere bilden.

Question 8

Was machen Leucin-Zipper?
Bespiele?

Answer 8

Leucin-Zipper-Dimere vermitteln Proteindimerisierung (und DNA-Bindung über basische AS wie Arginin).

Leucin-Zipper finden sich z.B. in folgenden Proteinen:
CREB, AP-1, C/EBP

Question 9

Wie sehen Helix-Loop-Helix Motive aus?

Answer 9

• Besteht aus einer kurzen und einer längeren amphipathischen Alpha-Helix, die in jeder 3. oder 4. Position eine hydrophobe AS hat.
• Die Helices sind über eine Schleife (“Loop”) verbunden.
• Durch hydrophobe WW entsteht ein Homo- oder Heterodimer: Dabei lagern sich typischerweise die beiden längeren Helices zusammen und binden den DNA-Strang über basische AS.

Question 10

Wo binden Helix-Loop-Helix-Motive?

Answer 10

Helix-Loop-Helix-Motive binden die DNA an charakteristischen palindromischen Sequenzen (E-Box) mit der Basenabfolge CACGTG.

Question 11

Wie kann man Transkripitonsfaktoren in vitro mit Affinitätschromatographie nachweisen?

Answer 11

1. Unter nicht strigenten (Beschreibung für den Grad der Exaktheit) Bedingungen werden alle Zellproteine gesäuelt. Die Säulenmatrix enthält viele verschiedene DNA-Sequenzen. Waschen mit niedrig konzen. Salzlösung. Eluieren mit medium-Salzlösung.
2. Das Eluat von Schritt 1 wird nun unter strigenten Bedingungen chromatisch getrennt. Die Säulenmatrix enthält nun nur eine einzelne bestimmte DNA-Sequenz. Alle Proteine, die nicht an die Säule binden, werden mit medium-konze. Salzlösung entfernt. Die gesuchte Proteinfraktion, die spezifisch an der Säulenmatrix gebunden hat, wird mit hoch konzent. Salzlösung eluiert.

Question 12

Durch welchen Immunoassay können DNA-Sequenzen identifiziert werden, die durch Proteine wie Transkriptionsfaktoren besetzt werden?

Answer 12

ChIP (Chromatin-Immunopräzipation)

https://www.youtube.com/watch?v=7_-Or4ARyH0

Question 13

Wie funktioniert ChIP?

Answer 13

1. Durch spezifische Antikörper gegen Transkriptionsfaktor, können entsprechende Proteine gefällt werden.
2. Das Präzipitat kann über PCR amplifiziert und sequenziert werden.
3. Alternativ kann mit Affinitätschromatographie (mit einer Matrix die anti-Transkriptionsfaktor-Antikörper enthält) das Protein, welches an die DNA gebunden ist, abgetrennt werden.

https://www.youtube.com/watch?v=7_-Or4ARyH0