Analysmetoder

Question 1

Vad innebär nefelometri och turbidimetri?

Answer 1

• Baseras på grumlighetsmätningar:
• Ju grumligare, desto mer av sökt analyt finns i systemet
  
  • Reagenset innehåller exempelvis antikroppar som binder till analyten och orsakar aggregering. Detta ger en ökad grumlighet
  • Ex D-dimer-analys
• Nefelometri mäter reflekterat ljus:
  
  • – Ju mer ljus till detektorn desto högre koncentration
• Turbidimetri mäter det ljus som passerar genom vätskan:
  
  • Ju mer ljus till detektorn desto lägre koncentration
• Nefelometri och turbidimetri mäter således ljusintensitet i olika vinklar som ett mått på systemets grumlighet. En kalibreringskurva krävs för att omvandla ljusintensitet till koncentration
  
  • Grumlighet 4,5 motsvarar ex 45 gram/L

Question 2

Hur fungerar en jonselektiv elektrod?

Answer 2

• Mäter koncentration av joner såsom Na+, K+ och Cl
• En elektrod sänks ned i provet
  
  • Elektroden har ett membran som är selektivt för sökt jon
  • I en idealsituation är det endast koncentrationen av denna som påverkar elektroden, övriga exkluderas från att påverka mätningen
• En potentialskillnad uppstår mellan elektroden och en referenselektrod. Potentianskillnaden omräknas till en koncentration via en kalibreringskurva

Question 3

Hur fungerar kolometrisk analys?

Answer 3

• Reagenset innehåller ämnen som i interaktion med vald analyt ger en färgomvandling. Analyten kan antingen vara substrat eller enzym i denna process
  
  • Exempel på analyt som substrat (kreatininanalys):
    
    • Kreatinin bryts ned i en reaktionsprocess av tre olika enzymer (som ingår i reagenset). Slutprodukten blir bland annat glycin och väteperoxid
    • Väteperoxid reagerar med ett ämne (ingår i reagenset) som ändrar färg
    • Färgintensiteten vid specifik våglängd är proportionerlig med koncentration kreatinin i provet och avläses från kalibreringskurva
  • Exempel på analyt som enzym (ALAT-analys) (en analyts enzymatiska egenskaper blir här viktigt för att kvantifiera analyten!)
    
    • ALAT (alaninaminotransferas) från patienten omvandlar alanin och 2-oxaglutarat i reagenset till pyruvat och glutamat
    • Bildat pyruvat reagerar med NADH (i reagenset) och bildar laktat och NAD+
    • NAD+ har lägre absorbans vid 340 nm än NADH
    • Koncentrationen ALAT är således proportionerlig till minskningshastigheten i absorbans vid 340 nm vilket avläses från kalibreringskurva

Question 4

Hur fungerar immunkemi?

Answer 4

• Används för bland annat hormoner och proteiner. Utnyttjar antikroppar för kvantifiering via två olika principer
  
  • Sandwich-principen (TSH-analys)
    
    • Reagenset innehåller två antikroppar mot olika epitoper på analyten
      
      • En antikropp med inbundet biotin
      • En antikropp med inbundet rutenium
    • Efter inkubering tillsätts streptavidin i ett andra reagens som binder till biotinet och kan fångas in till mätcell (elektromagnet), det andra sköljs bort
    • Vid elektromagneten appliceras en spänning vilket gör att ruteniummolekylen skapar en ljussignal som kan mätas
    • Ljussignalen är således proportionerlig mot analytkoncentrationen i provet
  • Kompetetiv princip (testosteronanalys)
    
    • Reagenset innehåller biotinmärkta antikroppar specifika för analyten
    • Antikropp och analyt binder till varandra men vissa antikroppar kommer att vara obundna då mängden antikropp överstiger mängden antigen (analyt)
    • Efter en inkubationstid tillsätts ett andra reagens innehållandes streptavidin samt ett ruteniummärkt substrat som kan binda till samma antikropp
    • Streptavidin binder till biotin på antikroppen och detta komplex binds via en elektromagnet till mätcellen
    • Patientens analyt hindrar alltså reagensets märkta analyt från att ge en ljussignal då dessa båda konkurrerar om antikropparnas bindningsställen
    • Ju mer analyt desto svagare ljussignal. Ljussignalen blir således omvänt proportionerlig mot koncentrationen av analyt i provet
• Antikroppar kan alltså användas för att selektivt binda in det vi vill mäta. Sedan kan vi mäta detta på olika sätt för att kvantifiera

Question 5

Hur fungerar cellräknare gällande Hb och EPK (erytrocyt partikel koncentration)?

Answer 5

• Används för blodstatus och differentialräkning
• Tre aspirationer görs och blodet genomgår sedan tre olika processer
• Hemoglobin:
  
  • Provet hemolyseras (slås sönder) vilket frisätter cellinnehållet (bland annat Hb) i plasma. Fritt hemoglobin stabiliseras med en bindarmolekyl vilket ger en jämn rödfärgning av plasma som mäts vid 550 nm
• EPK (erytrocytpartikelkoncentration) och TPK (trombocyter) mäts med en flödescytometer
  
  • Celler injiceras i ett flöde och passerar en spänning
  • Varje cell som passerar isolerar spänningen och storleken på resistensökningen är direkt proportionell mot cellstorleken
  • Antal celler och varje cells storlek registreras beroende på hur mycket varje passage ökar resistensen i mätcellen
  • Antal på x-axel och storlek på x-axel (bild nedan)

Question 6

Hur fungerar cellräknare gällande LPK och differentialräkning?

Answer 6

• Cellerna blandas med vätska som lyserar trombocyter och erytrocyter och gör leukocyternas cellmembran permeabelt
• Ett fluorescerande ämne tillsätts som färgar in RNA och DNA
  
  • De nu kvarvarande leukocyterna får olika utseende beroende på typ och flödar en och en genom en flödescytometer som registrerar:
    
    • Forward scatter – en cells skugga som således är proportionerlig mot storleken
    • Side scatter – en cells spridda ljus som är proportionerlig mot innehåll av granula (jämför nefelometri)
    • Side flourescent light – fluorecerande ljus som är proportionerlig mot cellens innehåll av RNA/DNA
  • Vänster (LPK)
    
    • Forward scatter (y-axel) – storlek
    • Side scatter (x-axel) – grumlighet/organeller
  • Höger
    
    • Side fluorence light (y-axel) – mkt RNA/DNA

Side scatter (x-axel) – grumlighet/organeller)

Question 7

Hur fungerar interferenser?

Answer 7

• Interfererande substanser: Innehåll i ett prov (del av matrisen) som stör mätningen av en analyt och kan orsaka felsvar
  
  • Hemolys
    
    • Sönderfall av erytrocyter ger läckage av intracellulära komponenter till plasma
    • Uppstår in vitro, oftast på grund av provtagning ur PVK eller användning av för tunn nål
      
      • Båda skapar ett turbulent blodflöde vari celler slås sönder
    • Hemolys ger interferenser baserat på två olika principer:
      
      • Rödfärgning av plasman av fritt hemoglobin
        
        • Ju mer rödfärgad plasman är desto svårare är det att göra mätningar baserade på färgförändringar eller ljusgenomsläpplighet
      • Ökad koncentration av vissa substanser i plasman
        
        • Intracellulärvätskan skiljer sig på många sätt från extracellulärvätskan
        • Cellsönderfall leder således till att bland annat K, LD och ASAT (som alla har en hög koncentration inne i cellen) stiger redan vid lätt hemolys
        • Vid kraftigare hemolysgrad förändras även andra ämnens koncentration
        • Hemolysindex
          
          • Via spektrofotometri mäts graden av rödfärgning av plasma vid 570 nm
          • Olika analyser har olika gränser för maximal tillåten hemolys baserat på dess känslighet för densamma
    • Ikterus
      
      • Bilirubin i plasma ger en gulfärgning som mäts med spektrofotometri
      • Interfererar med våra mätningar endast genom färgen som stör mätmetoder som baseras på ljus eller färgomslag
      • Olika analyser har olika maximal tillåten grad av ikterus
    • Lipemi
      
      • Höga koncentrationer lipider i plasma förekommer vid vissa familjära hyperkolesterolemier eller vid lipidinfusioner
      • Stör mätningar av ljusgenomsläpplighet och grumlighet

Question 8

Åtgärder vid interferens?

Answer 8

• Hemolys:
  
  • Ta om provet, undvik PVK och smala nålar (butterfly)
• Ikterus:
  
  • Välj om möjligt andra, mindre känsliga, analyter. Samråd med laboratoriet.
• Lipemi:
  
  • Undvik att ta prover under pågående fettinfusion, vänta helst några timmar
  • Om prover måste tas akut kan oftast laboratoriet ändå mäta efter ultracentrifugering