clonagem
produção de multiplas copias geneticamente identicas
para que pode ser usada a clonagem?
armazenar DNA ou para expressão
vetor de clonagem
transportam o gene que queremos clonar
tipos de vetores de clonagem
plasmídeos, fagos, cosmídeos, BAC, YAC, MAC
plasmídeo
elementos de DNA circular não cromossómicos. Contêm um gene que lhes confere resistência a um antibiótico.
fago
Têm cadeia dupla e DNA linear, o DNA incluído na cabeça do fago é transfetado para a E.coli
cosmídeos
combinação das propriedades dos fagos e dos plasmídeos
BAC
vetor artificial para bactérias
YAC
vetor artificial para leveduras
MAC
vetor artificial para eucariotas
plasmídeos conjugativos
contêm genes tra, que sintetizam o pilus sexual das bactérias
plasmídeos mobilizáveis
contêm genes mob e são capazes de transferir cópias de si próprio para outros
plasmídeos autotransmissíveis
têm genes tra e mob
plasmídeos integrativos
entram dentro da célula e integram-se no genoma na forma de epissoma
plasmídeos não integrativos
ficam no citoplasma
proteínas heterologas
expressas num organismo atraves de genes de outro organismo
zona de clonagem
local no vetor onde se adiciona o material genético
para que servem os marcadores
para avaliar se o DNA é recombinante e se a célula incorporou o vetor
gene reporter
reporta se a transformação aconteceu
como avaliamos se o vetor é recombinante
testamos a presença do lac z , se a célula tiver lac z produz uma cor azul, se houver DNA recombinante fica branco
como avaliamos se a célula incorporou o vetor
plaqueamos as células num meio seletivo que contém antibiótico, apenas as bactérias que têm o plasmídeo sobrevivem
células competentes
são células permeáveis a DNA, ou seja capazes de receber DNA recombinante.
como é que podemos tornar as células competentes?
Tratar com CaCl2 e choques elétricos.
transformação
aquisição de DNA livre pelas células