1
Q
la taille du génome définit l’intelligence ?
A
non (on se situe entre le raisin et la poule…)
2
Q
quel nucléotide est remplacé chez l’ARN
A
Uracile remplace thymine
3
Q
explique ces types d’ARN
constitutif
cassette exon
site alternatif 5’ ou 3’
rétention d’intron
exons mutuellement exclusifs
promoteur / terminateur alternatif (panel B)
A
4
Q
chez l’humain existe til plus de transcrits ou de protéines ?
A
protéines (1M)
transcrits (100k)
5
Q
Les modifications post-traductionnelles ne contribuent pas à la diversification protéique.
A
faux
6
Q
criblage classique vs inversé
phénotype connu ou inconnu?
séquence connu ou inconnu?
A
classique : phénotype connu, séquence inconnu
inversé : phénotype inconnu, séquence connue
7
Q
criblage classique vs inversé :
ils servent chacun a quoi pour les hypothèses ?
A
classique permet de générer une hypothèse (découvrir gènes impliqués)
inversé permet d’évaluer une hypothèse (tester gène candidat)
8
Q
criblage classique vs inversé :
combien de gènes a la fois ?
A
classique : milliers
inversé : un seul
9
Q
associe a classique ou inversé :
- Identifier les gènes importants pour un phénotype biologique
2.Sélectionner un gène et déterminer les phénotypes associés
A
1.classique
2.inversé
10
Q
le criblage classique se fait généralement avec de rongeurs (VF)
A
F, faut faire tlm de mutations c’est impossible
11
Q
5 étapes criblage classique
A
- élaborer un test afin de mesurer phénotype
- obtenir mutants
3.dépistage d’un phénotype anormal
4.classement/regroupement fonctionnel des mutants
- localiser le gène
12
Q
étape 1 criblage classique : quels sont les caractéristiques essentiels pour faire un bon test
A
simple, quantitatif et reproductible
aussi doit bien distinguer phénotype normal et anormal
13
Q
étape 2 criblage classique : 4 facons de faire mutations
A
mutations naturelles
mutagenèse chimique (EMS, ENU)
mutagenèse par irradiation (UV)
mutagenèse par insertion (transposon)
14
Q
mutation non sens vs faux sens vs silencieuse
A
non sens : fait un codon stop
faux-sens : changer aa
silencieuse : rien mais pourrait impacter epissage
15
Q
mutagenèse chimique : provoque quel genre de mutations
A
Provoque des mutations ponctuelles (un seul nucléotide)
16
Q
mutagenèse par irradiation
A
provoque des ruptures dans ADN double brin
génère des grandes délétions ou réarrangement du genre (délétion, inversion, insertion, duplication, translocation)
17
Q
si on veut ko quel mode de mutagenèse est priorisé
A
la mutagénèse par irradiation
18
Q
mutagenèse par insertion
A
Insertion d’une séquence d’ADN (souvent transposon avec marqueur)
19
Q
mutagenese par insertion que se passe til si insérer dans une region codante vs non codante
A
codante : protéine tronqué ou non fonctionnelle
non-codante : perturbe l’épiage ou la régulation de l’expression
20
Q
que fait on durant étape 3 du criblage classique
A
évalue entre 100 et 1000 lignées avec le test de l’étape 1
on garde les lignées mutantes
21
Q
est ce que la lignée F1 est bonne pour évaluer les phenotype
A
plutôt instable et mosaïque, mutations se fixent apres plusieurs générations
22
Q
on fait quoi durant étape 4 du criblage classique
A
complémentation et test allélique (forme de test de complémentation ou c’est complementaire, bizarre un peu)
23
Q
explique test de complémentation
A
permet identifier si 2 mutations récessives affectent le meme gène ou pas
croiser 2 mutant, si complémentaire (phénotype restauré), alors mutations est sur des gènes différents
si pas complémentaire, phénotype wild pas restauré, donc mutation sur même gène
24
Q
étape 5 criblage classique, quels techniques sont utiliser pour cartographier le gène
A
séquence du transposon (mutagenèse par insertion) (marqueurs)
ou analyse de liaison (mutagenese chimique et irradiation), suivre les recombinaison a l’aide des marqueurs pour localiser
en gros suivre les marqueurs, séquencer la région autour du site d’insertion
25
des malformations des circuits ou des
défauts dans les connexions synaptiques est un bon phenotype a observer en criblage classique chez drosophile ?
non, tres chiant faut ouvrir le crâne de chaque drosophile
si motivé fait le mais ya mieux
26
criblage inversé on prend quel espece ?
cellule humaine ou rongeur
27
siARN vs shARN
c'est quoi?
comment ils sont délivré?
siARN : petit ARN interférent délivré par injection
shARN: ARN courte épingle de cheveux délivré par plasmide ou virus (laisse la cellule possibilité de faire propre shARN)
28
comment les siARN et shARN fonctionne
Ko ou KD?
KD, réduit l'expression d'un gene en ciblant l'ARNm et provoquant sa dégradation (silencing génique)
en gros met double brin et le crops aim epas et détruit
29
trio de l'édition du génome
résume en 1 mot pour chaque
30
ZFN vs TALEN mécanisme
ZFN c'est une nucléase avec domaine de liaison doigt de zinc lié a une enzyme de coupure Fok1
se lie a chaque brin (dimère), avec un espacer de comme 5 nucléotide et Fok1 coupe l'adn
cassure double brin, entraine mutations en réparant
Talen genre meme chose mais utilise domaine TAL pour se lier (juste pas meme enzymes ca dit)
31
but de Crisprcas9 dans vrai vie
Inactiver l’ADN viral exogène en induisant une cassure double brin
32
2 composantes essentielles de CrisprCas0
1. protéine associé au Crispr (Cas9)
2.ARNg
33
Cas9
endonucléase clivant l’ADN et encodé dans l’opéron Cas du
chromosome bactérien
34
Locus CRISPR fait quoi
instructions essentielles à la synthèse de différents ARNg
35
ARNg possède 2 segments
ARN crispr qui sert a criblage ADN viral par appariement de base
ARN crispr trans-activant : palindrome adoptant structure 3D (échafaudage moléculaire) pour ancrage de l'ARNg
36
séquence PAM c'est quoi (en lien avec crisprcas9)
Mécanisme de sécurité. Motif de 3-5 nucléotides présent
uniquement de l’ADN cible du coté 3’
37
comment on créée l'ARNg
Créer un ARNg synthétique en modifiant la portion ARNcr pour cibler une
séquence cible.
38
VF : La séquence PAM peut varier
V, selon origine de la Cas9 (important prendre le bon PAM pour le Cas9)
39
2 voies de réparation suite a CrisprCas9
lequel pour KnockIn
1. Jonctions d’extrémités non-homologues (NHEJ)
2. Réparation par recombinaison homologue (HDR)
HDR pour KI
40
6 étapes utilisation Crispr/cas9
1. Sélection de la cible (région exonique importante du gène a inactiver)
2. Conception des ARN guides (gRNA)
3. Préparation du système CRISPR/Cas9
4. Introduction des mutations (KO)
5. Validation du Knock-Out
6. Contrôle des effets hors-cibles
41
2. Conception des ARN guides (gRNA)
caractéristiques de la séquence nécessaires
séquence proche du site de coupure et adjacent a un site PAM (essentiel pour cas9)
generalement NGG
42
algorithme en ligne aident a identifier les séquences ARNg optimales, ils tiennent compte de quels critères ? (3)
* La spécificité (éviter les sites hors-cibles).
* L'efficacité (probabilité de coupure réussie).
* La proximité des sites exoniques essentiels du gène.
43
3. Préparation du système CRISPR/Cas9
Deux principales méthodes sont utilisées
pour introduire le complexe CRISPR/Cas9 :
vectorisation via plasmides : permet expression durable, gène codant pour Cas9 et ARNg introduit dans cellules
électroporation de ribonucléotides : directement introduction Cas9 et ARNg (+rapide et - de risque mutations hors cible)
44
4. Introduction des mutations (KO)
(tu sais)
45
5. Validation du Knock-Out
comment vérifier que le gène ciblé est bien inactivé?
séquençage locus simple : séquençage pour vérifier que les mutations attendues(Indels) sont bien présentes
analyse de l'expression génique : analyse par qPCR et Western blot/immunohistochimie pour vérifier si ARNm absent
46
Si on a moin de ARNm, on a moin de protéine
faux, il faut savoir les séparer
47
5. Validation du Knock-Out
autre manière que par vérification gène
test fonctionnel (électrophysiologie ou comportemental)
voir comportement altéré
48
6. Contrôle des effets hors-cibles
comment faire
algorithme ARNg genere des listes de site similaire potentiellement affectés, il faut séquencer pour vérifier
49
2 types de marqueur utilisé pour criblage génétique et avantage et désavantage de chaque
microsatellites:
avantage : très polymorphique (varie d'un individu a lautre)
désavantage : couverture inégale, parfois des gars
micropuce SNP
avantages : grande quantité de marqueurs
désavantage : peu polymorphique
50
micro satellite comment faire criblage avec
amplifier PCR, lecture taille des fragments
51
criblage micropuce SNP comment faire
Pour chacun des SNPs présents sur la puce, il y a deux
sondes (correspondant à chacun des nucléotides (ACTG)).
hybridation avec ADN fluo, enregistre le signal et on peut faire haplotype avec tt les SNPs
52
Analyse de liaison c'est quoi
l'arbre des grandes famille avec maladies mendélienne
calcul d'un score LOD significatif a 3
53
analyse de liaison:
Les recombinaisons ne déterminent jamais les jonctions du locus (VF)
non , Les recombinaisons déterminent les jonctions du locus
54
Études d’association (GWAS)
c'est quoi
utilisation SNPs comme marqueur pour comparer fréquence d'un variant rare (maladie complexe) dans un grand groupe
55
gwas utilise quel graphique
Le graphique de type Manhattan (démontre les SNPs
avec une association aux traits/maladies étudiés)
56
Le séquençage de l’exome permet d’identifier...
les variants codants.
57
avantage et désavantage du séquençage de l'exome
Avantages: Identifie directement les variants potentiels, ne nécessite pas de grandes familles,
toutes maladies/traits
Désavantages: Couvre 2% du génome (régions codantes seulement), plus dispendieux
58
mécanisme séquençage de l'exome
fragmenter ADN, hybrider avec des sondes correspondant aux exons, nettoyer pour garder ADN hybridé
preparer librairie, sequencer et analyse bio-informatique
59
séquençage du génome permet identifier quoi
les variants codants et non-
codants, CNVs et expansion de répétitions
60
avantages et désavantages
séquençage du genome
Avantages: Identifie directement les variants potentiels, ne nécessite
pas de grandes familles, couvre le génome en entier (ou presque …)
Désavantages: Dispendieux, limitation dans l’interprétation des
données (que font les introns ?)
61
Le criblage inversé chez l’humain va souvent être suivi d’un criblage classique
dans un modèle animal afin de valider l’association génotype-phénotype.
(VF)
F, Le criblage classique chez l’humain va souvent être suivi d’un criblage inversé
dans un modèle animal afin de valider l’association génotype-phénotype.
62
mécanisme séquençage du genome
fragmenter ADN, preparer de la librairie, séquencage et analyses bio-infomratiques
63
Pourquoi effectuer un criblage in silico?
Afin d’identifier par une approche bio-informatique des gènes ou protéines
d’intérêts
permet identifier des gènes/fonction/prot similaire dans d'autres espèces
64
3 type de criblage in silico
BLAST, Ensembl et UCSC genome browser
65
comment effectuer un BLAST
entrer une sequence ADN ou prot en ligne
comparaison avec base de donnée mondiale (NCBI)
résultat : alignement avec séquences homologues + score de similarité
66
Criblage in silico: Ensembl
c'est quoi et sert a quoi
base de données et un navigateur génomique
permet de comparer les génomes de nombreuses espèces et extraction de séquences ou régions d'intérêts
67
teamwork entre Gwas et ensembl
Après l’identification d’un locus par un GWAS ou une analyse de liaison, Ensembl permet de visualiser cette
région, d’explorer les gènes candidats et de comparer leur conservation entre espèces.
68
différence entre Ensembl et UCSC genome browser
ensembl plus comparaison entre espèces, annotation
UCSC plus riche humain et maladies, intègre données clinique et fonctionnelle bcp
69
UCSC permet quoi
Visualisation et exploration des génomes complets (focus sur humain)
avec fonction BLAT : alignement rapide d'une séquence (semblable a BLAST)
70
quel criblage in silicone a plusieurs tracks personnalisables ?
UCSC
71
2 facons de faire criblage moléculaire avec avantages et désavantages pour chaque
micro puce d'expression (ADNc)
avantages :Analyse simple, peu coûteux
désavantage : sondes prédéterminées, pp détecter transcrits faiblement exprimé
séquençage d'ARN (ARN-seq)
avantages : Séquençage de tous les
transcrits exprimés dans le tissu,
possibilité de détecter les transcrits de
faible abondance
désavantage : plus cher, nécessite expertise
72
pourquoi faire un criblage moléculaire ? (sert a quoi) (3)
identifier des gènes en lien avec un
processus biologique spécifique
Mesurer l’expression de milliers de gènes en
parallèle.
Comparer conditions (traitement vs contrôle,
tissu A vs B)
73
comment faire un criblage moléculaire micro puce d'expression ADNc
ADNc produit par extraction de l'ARN
coupler ADNc avec fluorochrome
ADNc chargé sur puce(avec sondes correspondantes a séquence des gènes) et les séquences complémentaires s'hybrident
lecture
La présence de signal ou l’intensité du signal est
utilisée pour déterminer l’expression.
74
3 protocoles diffèrent peuvent être utilisés pour séquençage d'ARN
1. Sélection poly-A
2. Déplétion d’ARN ribosomale
3. Sélection par la taille (cible les petits ARNs)
75
comment faire séquençage d'ARN (ARN-seq)
* Conversion en ADNc
* Production de la librairie
* Séquençage et analyses bio-informatique
76
La PCR permet...
d’amplifier les fragments d’ADN.
77
La PCR a besoin de quoi?
ADN polymérase thermostable,
la Taq polymérase, et nécessite
des amorces d'ADN
conçues spécifiquement pour la région d'ADN d'intérêt.
78
PCR vs RT-PCR en terme de produit
PCR : amplification ADN->ADN
RT-PCR : ARN->ADNc
79
étapes d'un PCR (3)
1) créé oligonucléotides complémentaires (amorces)
2) tout mettre dans un tube (Taq polymerase + amorces + nucléotides + H20 + buffer + matrice)
3)mettre dans machine et faire cycle dénaturation, hybridation(oligo), extension(taq) genre 40x
80
RT-PCR quantitatif : but
Détection du signal fluorescent qui est créé proportionnellement aux produits amplifiés par la PCR, analyse ARNm après conversion en ADNc
81
différence démarche qRT-PCR comparé au PCR normal
meme étapes, mais incorporer fluorescence pour mesurer signal durant amplification ( début phase exponentielle)
donc on mesure pas en saturation (PCR oui), on mesure quand ca monte
82
2 approches pour quantifier RT-PCR
**Fluorescence SYBR green** : colorant fluorescence liant de manière préférentielle ADN double brin
**sonde Taqgman** : PCR a 3 oligo (2 amorces et 1 sonde)
sonde lié a fluo et QUENCHER. durant amplification Quencher est détaché et fluo émet un signal
Sonde est plus specifique aux genes
83
Le clonage moléculaire = clonage reproductif?
explique
Non, c’est une technique de labo pour
amplifier et manipuler un fragment d’ADN.
(obtenir grande quantité ADN et pourvoir étudier et stocker )
84
elles sont souvent utilisé comme hôte pour clonage moleculaire
bactéries
85
3 choses necessaire dans vecteur
Oriv (origine de réplication), marqueur de selection et multiple sites de restriction
86
2 types de vecteur
vecteur de clonage : réplication slm, pas d'expression (pour produire ADN)
vecteur d'expression : réplication + expression (contient promoteur adapté)
87
comment on fait clonage moléculaire (4)
préparer vecteur ( ouvrir avec enzymes restrictions)
préparer l'insert (amplifié par PCR, digérer avec enzymes de restrictions))
ligation insert et vecteur
transformation (insert est inséré)
88
2 méthode pour faire criblage des colonies suite a clonage moléculaire (vérifier c'est lesquels nos vecteur modifié)
**sélection négative** (bleu blanc) : utilisation métabolisme lactose, A-peptides présent dans vecteur et produit b-galactosidase (insert perturbe ce peptide)
donc bleu = vecteur sans insert
blanc = vecteur avec insert
**sélection positive** : Vecteur exprime un gène léthal, insert perturbe le gène et donc seulement ceux avec insert restent en vie
89
comment purifier ADN avec electrophorèse sur gel d'agarose (4)
1. Préparer le gel d’agarose
2. Préparation des échantillons (ajouter un colorant)
3. chargement sur le gel (enlever le peigne et mettre tampon dans la cuve , puis CHARGER les échantillons dans les puits)
4. mettre entre 20-100 volts de courant
90
Cathode (-) <--> anode (+) ?
Cathode (-) → anode (+)
91
ADN est chargé négativement ou positivement
négativement
92
corrélation force du courant et vitesse de migration
corrélation directe positive, mais moin bien fait
Élevé = migration rapide; Bas = séparation plus claire
93
comment visualiser de l'ADN dans un gel
utilisation d'agents intercalants genre bromure d'éthidium et Redsafe (fluo quand UV)
intensité de la bande d'ADN est basé sur le nbr et la taille des fragments
Le chargement d’un poids moléculaire permet de déterminer la taille
94
ecq le gel d'agarose peut permettre de savoir la séquence de l'ADN
NON
95
5 étapes de la séquencage de type Sanger
1. réaction synthèse des brins (PCR avec polymérase et ddNTPS)
2.des ddNTPS avec fluo aussi ajouté
3. dès qu'un ddNTP fluo est ajouté la réaction se termine
4.réaction chargé dans un capillaire (gel acrylamide)
5. laser fait lecture des fluo
96
résumé
97
5 méthodes pour déterminer le role que joue les protéines
1. Production d’anticorps
2. Purification des protéines
3. Expression des protéines
4. Interaction protéines-protéines
5. Interaction protéine-ADN
98
Épitope
Région de l’antigène reconnue par l’anticorps.
99
sont utilisé pour isoler /lier une protéine
les anticorps
100
6 étapes production d'anticorps monoclonaux
1. antigène dans animal
2. anticorps rate sont isolé
3.coculture avec tumeurs (myélomes)
4.cellule fusionnent avec hybridome
5.cultivation hybridome et cellule exprimant anticorps sont sélectionnées
6. expansion clones et production anticorps
101
4 étapes production anticorps polygonaux
1. antigène dans animal
2. Cellule B font anticorps
3. prélèvement du sang et centrifugation pour isoler le sérum
4.purifier anticorps en utilisant colonne qui contient antigène
102
Avec des protéines purifiées, on peut faire quoi (3)
* Utiliser comme antigène pour générer
des anticorps
* Déterminer la séquence protéique
* Identifier les interactions entre protéines
103
2 méthodes de purification de protéines et explique vite
chromatographie : purification GÉNÉRALE basée sur tag ou propriété physico-chimique
immunoprécipitaion : purification
SPÉCIFIQUE d’une protéine d’intérêt
depuis un mélange complexe.
104
différente caractéristique qu'on peut utiliser pour séparer pour chromatographie
separation est dependante de... (3)
* séparation par charge, taille, hydrophobicité
* Affinité d’une protéine
* La séparation est dépendante du type de matrice, du
tampon et des propriétés intrinsèques de la protéine
105
différents courants qu'on peut utiliser en chromatographie
chromatographie d'exclusion de taille, échangeuse d'ions et d'affinité (plus utilisé en recherche)
106
repose sur la spécificité anticorps–antigène pour
isoler une protéine d’intérêt depuis un mélange complexe.
immunoprécipitation
107
4 étapes immunoprécipitation
1. préparer lysat cellulaire rempli de prot
2. ajout anticorps pour capturer prot voulu
3. complexe est précipité en bille
4.récupéré les billes pour purifié
108
méthodes pour mesurer l'expression des prot (5)
dernière étape
western blot, ELISA, radioimmunologie, Immunomicroscopie électronique, Immunohistochimie
109
western blot possible avec C elegant ?
non
110
Western blot est il quantitatif?
si non quel solution est mieux
pas tres quantitatif, Elisa si tu vx quantitatif
111
dans le gel du western blot : les protéines de grande taille migrent _________ (lentement ou rapidement)
de petite taille migrent ___________
(lentement ou rapidement)
grande taille lentement
petite taille rapidement
112
western blot avec SDS gel dénaturant vs avec gel natif change quoi
gel dénaturant SDS fait la migration en fonction du poids
gel natif fait migration en fonction du poids et de la charge
113
on a besoin de quoi pour immunobuvardage ?
1. Anticorps primaire (reconnaissance de notre protéine d’intérêt)
1. Anticorps secondaire conjugué avec un isotope radioactif, une enzyme
(HRP), ou un fluorophore (reconnaissance de notre anticorps primaire)
114
Fractionnement cellulaire c'est quoi
séparées dans la solution
par une série d’étapes de centrifugation. (poids)
115
Alternative au Western Blot
Elisa
116
différences de Elisa avec western blot (4)
* Peut quantifier des nanogrammes de protéines (WB – microgrammes)
* Pas de dénaturation
* Ne permet pas de distinguer les isoformes (protéines tronquées)
(dans western c'est 2 bandes donc distinguables)
* Quantification plus précise
117
Essai
radioimmunologique (RIA) sert a quoi
déterminer le ratio de protéines liées: non-liées
afin d’identifier la concentration d’un échantillon
118
Essai
radioimmunologique (RIA):
peu ou très sensible ?
Très sensible pour mesurer les concentrations très basses de
protéines
119
Essai
radioimmunologique : analyse quel sorte d'échantillons habituellement
sang,
liquide extracellulaire, ou liquide céphalorachidien
120
co-immunoprecipitation : c'est quoi et comment faire si on connais le partenaire vs si on sait pas
savoir si une protéine interagit avec une autre
Si tu connais déjà le partenaire potentiel → tu confirmes par WB.
Si tu ne sais pas → tu identifies avec la spectrométrie de masse
121
Spectrométrie de masse, c'est quoi
Détermination effectuée par le ratio masse à charge des protéines, peptides et leurs fragments
( on comparent la masse calculée des fragments de protéines et peptides a une base de données)
122
Étudier l’impact des protéines sur la transcription (interaction prot-ADN)
3 méthodologies principales:
1. Test de mobilité électrophorétique (EMSA)
2. IP de chromatine (ChIP)
3. Essai de luciférase
123
EMSA (test de mobilité électrophorétique) sert a quoi
déterminer si une protéine est capable d’interagir
directement avec une courte séquence spécifique d’ADN (complexe ADN-prot migre plus lentement)
124
mécanisme EMSA
* L’ADN est marqué radioactivement ou avec la fluorescence
* On mélange l’ADN avec des protéine purifiées
* On charge sur gel et on fait migrer migration
125
avantage et désavantage EMSA
Avantages: Détecte les événements de faible quantité, peut
tester plusieurs sondes avec le même lysat
Désavantages: in vitro, pas quantitatif
126
IP chromatine (ChIP) sert a quoi
déterminer si une protéine interagit avec une
région d’ADN spécifique
127
5 étapes IP chromatine
1. Liaison de la protéine a l’ADN
2. Sonication pour fragmenter
3. Immunoprécipitation avec un anticorps
4. Inverser la liaison
5. PCR et chargement sur gel
128
controle negatif vs positif Ip chromatine
Contrôle négatif: anticorps non-spécifique (Ig) et amorces non-
spécifiques. On ne devrait pas avoir de signal
Contrôle positif: input. ADN avant immunoprécipitation
129
avantage et désavantage IP chromatine (Chip)
Avantage: Matériel de départ = cellules vivantes
Désavantage: Impossible de déterminer si une protéine
interagit avec une séquence d’ADN directement ou si elle fait
partie d’un complexe
130
différence ChIP et Chip-seq
Même approche que le ChIP , mais l’ADN libéré est séquencé (séquençage à haut débit)
L’analyse bio-informatique permet de distinguer les interactions.
Chip-seq bon quand aucune idée des interactions
131
avantage et désavantage ChIP-seq
Avantage: pas limité par des sondes prédéterminées
Désavantages: Dispendieux, nécessite plus de tissus
et une expertise pour l’analyse
132
essai luciférase sert a quoi
Déterminer si une protéine peut activer ou réprimer
l’expression d’un gène cible par la bioluminescence
133
avantage et désavantage essai luciférase
Avantages: Connection fonctionnelle, quantitatif
Désavantage: Ne peut pas détecter si interaction directe
NSC2003
flashcards
Decks in class (7)
# Cards
