Élecrophorèse pulsée
- pour les grands segments d’ADN car sur gel d’agarose le critère de taille ne peut plus être pris en compte
- donc champ pulsé = à intervalle régulier, la polarité du courant est inversé et le temps que les fragments d’ADN fassent l’aller-retour dépend de leur taille
Immunonéphélémétrie
- utilisation d’un Ac dirigé vs l’Apo(a) qui vont se complexer et former des particules en suspension
- faisceau lumineux est envoyé ce qui diffuse le faisceau et on mesure ensuite son intensité
- le phéno de diffusion dépend de la taille
Méthode ELISA
- utilisation d’un Ac de capture et un Ac de révélation
Isoélectrofocalisation
- électropho sur gel de polyacrylamide sur un gradient de pH
- les ApoE vont migrer jusqu’à leur pHi
Ultracentrifugation
Technique de séparation ?
Séparation par densité
Ultracentrifugation
Mécanisme ?
Accélération qui s’exerce vers l’extérieur et qui est prépondérante à l’agitation moléculaire donc séparation des molécules
Ultracentrifugation
Les 2 types ?
=> Ultracentrifugation en séquentielle :
Ajustement de la densité grace à des sels
On récupère les LP les unes apres les autres
=> Ultracentrifugation en gradient :
On met des solutions salines de différentes densité, on fait un seul tour et on peut récupérer les LP
Ultracentrifugation avantages
—> PREPARATiON des LP sur gros ou petit volumes
—> Plusieurs échantillons en même temps
Ultracentrifugation inconvénients 5
—> Pas de séparation des CM des LDL
—> Pb de densité de la Lp(a)
—> Des apo peuvent se décrocher
—> Prend du temps surtout la séquentielle
—> Volume important nécéssaire pcq rendement pas ouf
Électrophorèse sur polyacrylamide type de séparation ?
Séparation par taille
Les 3 types d’Électrophorèse sur polyacrylamide
- PAGGE (taille et forme)
Étude de la taille des LP :
- Les LDL sont plus gde que les HDL elles sont bloquées vites et reste au sommet
- HDL zones larges et pas LDL (pattern A ou B)
- Que pour HDL et LDL pcq VLDL et CM trop gros - PAGE SDS
Étude des Apo : gel de densité uniforme
Les prot deviennent négative car le SDS s’est fixé dessus donc pas de séparation en fonction de la charge
On obtient log(M) = f(mobilité relative) - PAGE en non dénaturante : charge, taille forme
Électrophorèse sur polyacrylamide avantages 4
“—> Petit V d’échantillon
—> Pls échantillons en même temps
—> Préparation d’Apo = méthode préparative
—> Pas de recoupement de la Lp(a) “
Électrophorèse sur polyacrylamide inconvénients 2
—> Pas préparative pour les Lipoprot
—> Pas d’analyse des CM ni des VLDL
Electrophorèse sur agarose
Type de séparation ?
Séparation par charge le courant va du - vers le +
Electrophorèse sur agarose 2 avantages
—> Faible V
—> Plusieurs en même temps
Electrophorèse sur agarose 2 inconvénients
—> Recoupement de certaines LP
—> Pas une méthode préparative pour les LP
Chromato d’exclusion
Phase stationnaire
Phase mobile
Principes de séparation
Phase stationnaire : mélange de billes dont les pores sont de tailles variables
Phase mobile : tampon quelconque
Principe :
Un petit constituant va mettre du temps à passer vs un gros qui va être arrêté très vite
Les grosses particules sortent les premieres
Chromato d’exclusion 3 avantages
—> méthode préparative / quantitative
—> rapide mais que 1 échantillon
—> Séparation douce
Chromato d’exclusion 4 inconvénients
—> Plus diluées à cause des tampons
—> Que sur des petits volumes
—> Pas de séparation de la Lp(a)
—> Risque de contamination des LP par des prot plasmatique
Chromato d’affinité
Phase stationnaire
Phase mobile
Principes de séparation
Phase stationnaire : billes avec un Ac
Phase mobile : tampon de basse force ioniques
Principe :
ApoAI va se fixer sur son Ac anti ApoAI
Puis on fait passer un tampon de forte force ionique
Spectrophotométrie
Chromogène coloré quand il est oxydé et mesure de l’absorbance
Réaction de Trinder
