Opišite princip svjetlosne mikroskopije
svjetlosni mikroskop je optički instrument u kojem slika nastaje sakupljanjem vidljive svjetlosti s promatranog objekta pomoću
optičkih leća (λ=0,4-0,7 μm)
princip: izvor svjetlosti je žarna nit; leća (kondenzor) prikuplja zrake svjetlosti i usmjerava ih na uzorak koji mora biti dovoljno tanak da propušta zrake; dio zraka koji prođe kroz uzorak prolazi kroz sustav leća (objektiv i okular) te zraka svjetlosti dolazi do našeg oka
Objektivna leća stvara povećanu stvarnu sliku. Okularna leća (ona kroz koju gledaš) dodatno povećava tu sliku, koju oko vidi kao virtualnu sliku.
Objasni princip elektronske mikroskopije
izvor zraka: elektroni
rezolucija: 1 Å=10⁻¹° m= 0,1nm; 100x bolja rezolucija od svjetlosnog
podjela elektronskih mikroskopa: TEM (Transmission Electron Microscope)-elektromagnet usmjerava elektrone na uzorak koji je fiksiran i osušen; dio elektrona prolazi kroz uzorak i usmjerava se pomoću elektromagnetske leće na fluorescentni zaslon i stvara sliku (slika jednog presjeka) i SEM (Scanning Electrone Microscope)-elektroni se iz izvora usmjeravaju kroz EM i dolaze do uzorka koji je presvučen elektrovodičem (metal, Pt, Hg, Pb) i udaraju u njega; dio se apsorbira, a dio se reflektira od površine uzorka; uzorak (atomi metala) emitira sekundarne elektrone koji se detektiraju, a slika nastaje na zaslonu (kombinacija slika presjeka)
Nabroji tehnike pripreme uzorka kod elektronske mikroskopije
diferencijalno bojanje
mikrotomski presjek
eng. freeze-fracture
eng. freeze-etch
Objasni i opiši princip difrakcije x-zraka
rendgenska difrakcija je nedestruktivna analitička metoda za određivanje kristalografske strukture, kemijskog sastava te fizičkih osobina materijala, koristi se za proučavanje strukture makromolekula
princip: Rendgenska zraka sudara se s elektronima u kristalima proteina. Pri sudaru dolazi do raspršivanja zraka i te zrake međusobno interferiraju. Neke se pojačaju, a neke oslabe ili ponište ovisno o položaju atoma u strukturi proteina. Rotiranjem kristala dobije se rendgenska fotografija s nizom točaka tj. zacrnjenja na slici. Rezultate obrađuje računalo Furierovim transformacijama. Na osnovu mapa elektronske gustoće može se odrediti položaj atoma, odnosno jezgri -> u
središtu najveće gustoće atoma nalazi se jezgra.
Nabroji metode za dobivanje ekstrakta stanica
ultrazvukom
osmotskim šokom
u tarionicima i kugličnim mlinovima
propuštanjem kroz mali otvor pod visokim tlakom
Objasni princip gel-kromatografije
analitička metoda za razdvajanje tvari različite veličine (molekulske mase)
- tvari različite molekulske mase prolaze različite puteve kroz kolonu
- manje molekule ulaze u pore kuglica gela (čvrsta, stacionarna faza) te zbog toga prolaze dulje puteve, dok veće molekule ne ulaze u pore gela već ih zaobilaze zbog čega prolaze kraći put i prije izlaze iz kolone
- SF: kuglice gela; MF: pufer sa smjesom molekula koje želimo razdvojiti
- pokretačka sila: peristaltička pumpa
- primjena: razdvajanje proteina, polisaharida i nukleinskih kiselina, odsoljavanje, pročišćavanje te određivanje Mr proteina tako da se prvo napravi baždarni dijagram ovisnosti Mr o retencijskom vremenu za proteine poznatih Mr
Objasni princip diferencijalnog centrifugiranja i centrifugiranja u gradijentu gustoće
diferencijalno centrifugiranje: razdvajanje staničnih sastojaka na temelju razlike u veličini i masi pri čemu se oni veći talože pri manjim RCF i kraćem vremenu
centrifugiranje u gradijentu gustoće: razdvajanje na principu razlike u brzini sedimentacije/razdvajanje na principu razlike u gustoći; potreban je medij različite gustoće kojim će se napraviti gradijent (najčešće polimerni materijal, rjeđe soli i manji šećeri) te tvari otapaju se u određenim količinama u puferu što daje određenu gustoću u određenim dijelovima epruvete (npr. gustoća se smanjuje od dna prema vrhu); duljina gradijenta mora omogućavati razdvajanje molekula (što je veća razlika u masi i veličini molekula, to je potreban kraći gradijent i centrifugiranje pri manjim silama)/uzorak se može nanijeti u bilo koji sloj gradijenta i čestice odnosno sastojci stanice će se zaustaviti u sloju gradijenta koji ima jednaku gustoću
Objasni princip kromatografije na ionskom izmjenjivaču
omogućava razdvajanje iona ili molekula s nabojem jer se separacija odvija na temelju različitog naboja tj. djelovanjem ionskih veza
princip: propuštanjem smjese kroz kolonu, na skupine izmjenjivača vežu se protuioni dok molekule istog naboja prolaze kroz kolonu; kako bi se vezane molekule otpustile sa SF (matriks sličan gelu za gel filtraciju, ali supstituiran nabijenim grupama), može se promijeniti pH pufera jer se time utječe na protoniranost/deprotoniranost skupina koje se vežu ili promijeniti ionsku jakost jer ioni soli u MF konkuriraju za vezanje na skupine SF
Objasni princip afinitetne kromatografije
temelji se na svojstvu molekula da specifično vežu neki ligand
princip: smjesa se propušta kroz kolonu, pri čemu dolazi do nekovalentnog vezanja liganda s određenom komponentnom smjese koja se s kolone može eluirati tako da se kroz kolonu propusti pufer s visokom koncentracijom istog liganda (dobivamo željene molekule s vezanim ligandom); pufer s konkurentnim molekulama za vezanje na ligand (dobivamo same molekule, nisu vezani ni na što); denaturirajućim puferom pri čemu, ako je u pitanju protein ili enzim, denaturacijom se gubi nativna konformacija te dolazi do otpuštanja proteina i eluacija
Objasni princip HPLC-a
High Pressure Liquid Chromatography-visokoučinkovita tekućinska kromatografija
-uglavnom se koristi u analitičke svrhe
princip: vrlo čisti uzorak, pročišćen filtracijom kroz nitrocelulozne filtere, injektira se u MF te prolazi kroz kolonu punjenu SF; komponente uzorka ulaze u interakcije s MF i SF što određuje brzinu eluiranja tj. vrijeme zadržavanja pojedinih komponenti unutar kolone; daljnjim eluiranjem s MF, uzorak dolazi do detektora (npr. UV/VIS-detektor) koji detektira mjerni signal
objasni princip NATIVE-PAGE elektroforeze
nativna poliakrilamidna gel elektroforeza
-razdvajanje molekula se temelji na razlici GUSTOĆI NABOJA odnosno omjeru naboja i molekulske mase
-princip: uzorak se nanese na poliakrilamidni gel određene gustoće; djelovanjem električnog polja, molekule s pozitivnim nabojem (kationi) kreću se prema katodi, a molekule sa negativnim nabojem (anioni) prema anodi; njihova brzina kretanja ovisit će o njihovoj veličini jer velikim molekulama gel pruža veći otpor pri prolasku, ali i o količini naboja jer molekule s više naboja putuju brže što je gustoća naboja VEĆA (veći netto naboj, manja molekulska masa) to će molekule putovati brže
Objasni princip plinske kromatografije
SF- kruti adsorbens (GSC:gas-solid chromatography) ili tekućina (GLC:gas-liquid chromatography) vezana na čvrsti nosač adsorpcijom ili kemijskom vezom
MF- kemijski inertni plin (carrier gas, plin nositelj, ne reagira s molekulama analita) -> njegova funkcija je transportirati analit kroz zagrijanu kolonu
princip: kao i kod tekućinske kromatografije, uzorak nošen mobilnom fazom prolazi kroz stacionarnu fazu pri čemu se komponente razdvajaju na temelju različitih afiniteta za vezanje na SF i MF; razdvojene komponente se detektiraju pikovima na kromatogramu
Objasni princip SDS-PAGE elektroforeze
molekule (najčešće proteini) se prije nanošenja denaturiraju sa SDS-om; anionskim detergentom (Na-dodecilsulfat) koji ima hidrofoban rep i hidrofilnu sulfatnu grupu koja nosi negativan naboj…kada uđe u interakcije s molekulama (proteinima), ona sa svojim hidrofobnim repom stvara hidrofobne interakcije s proteinima i denaturira ih
-SDS sa sobom nosi puno negativnog naboja koji maskira pravi (nativni) naboj proteina -> ima nemjerljivo više negativnog naboja nego pozitivnog pa se taj pozitivan naboj ni ne primjećuje (prevladavat će -)
-SDS se na protein veže u određenom omjeru; što protein ima veću molekulsku
masu, vezat će se više SDS-a, tako da sada svi proteini imaju jednaku gustoću naboja (naboj/masa=konst.) pa bi se svi trebali u električnom polju kretati jednakom brzinom (nativni naboj više nema ulogu u brzini kretanja) -> brzina sada ovisi samo o tome koliko ih gel jako zadržava odnosno samo o
molekulskoj masi
Objasni princip izoelektričnog fokusiranja
elektroforetska metoda razdvajanja molekula u gradijentu pH na osnovu njihovih različitih izoelektričnih točaka
princip: na poliakrilamidni gel se, prije razdvajanja, nanesu amfoliti (male organske molekule s poliamino-polikarboksilnim skupinama koje u električnom polju putuju prema suprotno nabijenim elektrodama sve dok se ne postigne netto naboj jednak nuli…one stabiliziraju pH gradijent); po završetku koncentriranja amfolita, postignut je pH gradijent u gelu; nanošenjem proteina na tako pripremljen gel, proteini migriraju prema suprotno nabijenoj elektrodi, a zaustavljaju se na dijelu gela u kojem je pH vrijednost jednaka njihovoj pI vrijednosti jer ih jednake privlače i katoda i anoda
Objasni princip 2D-elektroforeze
metoda u kojoj se vrpce, razdvojene na jednom gelu, naknadno razdvoje na drugom gelu, sa ili bez tretmana prije druge elektroforeze; najbolje se razdvajanje postiže kada su načela razdvajanja različita
-princip za IEF (nativni)SDS: smjesa proteina nanese se na gel s gradijentom pH te se provede izoelektrično fokusiranje; nakon razdvajanja proteina, potrebno je omogućiti prijelaz u gel za SDS-PAGE, a s obzirom na to da im je netto naboj 0, to se ne može postići primjenom struje; zato se gel nakon IEF obrađuje SDS-om koji denaturira proteine te im daje negativni naboj čime se omogućava migracija u SDS-PAGE gel pomoću električnog polja; traka IEF gela se postavi okomito na smjer razdjeljivanja u SDS-PAGE gelu
Objasni princip UV/VIS spektrofotometrije
UV/Vis-područje ultraljubičastog i vidljivog dijela spektra (200-800 nm)
princip: izvor zrači zračenje u UV i Vis spektru koje prolazi kroz monokromator gdje dolazi do disperzije svjetlosti na zrake različitih valnih duljina; te zrake svjetlosti dolaze do zrcala gdje se djelomično reflektira, a djelomično prolazi; snop zraka koji je prošao kroz zrcalo, prolazi kroz referentni uzorak, a reflektirani snop kroz zadani uzorak; svaki od tih snopova prolazi kroz svoj detektor nakon čega se te vrijednosti prikazuju kao omjer intenziteta propuštene svjetlosti i intenziteta upadne svjetlosti
Objasni princip uvođenja točkastih mutacija
uvođenjem točkastih mutacija ili nekih kemijskih modifikacija, može doći do gubitka mjesta vezanja koenzima NAD⁺/FAD/NADP⁺ na enzim pa se koncentracija koenzima može pratiti spektrofotometrijski
Objasni primjenu mikrosenzora za određivanje aktivnosti enzima
koriste se mikrosenzori kisika koji rade na principu smanjenja inzenziteta fluoresencije (quenching), a različite se koncentracije kisika postižu upuhivanjem kisika, zraka ili N₂; nakon upuhivanja se dodaje enzim koji troši kisik i prati se pad koncentracije (računanje brzine potrošnje kisika)
Objasni princip kapilarne elektrokromatografije
metoda koja povezuje HPLC i CE (kapilarnu elektroforezu) tj. metode tekućinske kromagrafije u kojoj se pokretna faza potiskuje kroz sustav primjenom elektroosmoze
-princip: elektrolit prolazi kroz kolonu (kapilaru) tjeran električnim poljem, nakon čega se detektira UV/Vis spektrofotometrijom, fluorescencijom ili spektrometrijom masa
Što je luminiscencija
pojava emitiranja svjetlosti određene valne duljine nakon pobuđivanja molekula u nekoj tvari
Objasni princip fluorescentne spektrometrije
princip: elektroni spoja, koji je obasjan zračenjem, prelaze iz osnovnog stanja u viši nivo (S₁ ili S₂) no tamo nije stabilan pa se vraća u niži nivo, a energija se pritom manifestira (emitira) kao fluoro- ili fosforescencija
Objasni primjenu GFP proteina kod fluorescentne spektrometrije
GFP (green fluorescent protein)
gen za GFP unese se prije ili nakon željenog gena za protein te kada dolazi do ekspresije tog gena, eksprimira se i gen za GFP koji svijetli pod UV-zračenjem (nekovalentno obilježavanje proteina)
primjena: obilježavanje stanica i organela, porijeklo stanica, marker kod fuzije, ekspresija gena, protein-protein međudjelovanje, lokalizacija proteina, proučavanje količine eksprimiranog proteina, praćenje zamatanja proteina
Objasni princip protočne citometrije
vrlo precizna metoda koja koristi principe
apsorpcije svjetlosti, rasapa svjetlosti, pobuđivanja svjetlošću i emisije svjetlosti određene valne duljine
princip rada: kroz centralnu cijev se propušta uzorak (obilježavan bojama, markerima,.. ne radioaktivno..) a oko centralne cijevi se propušta plin tako da se usmjeri uzorak (hidrodinamičko fokusiranje) u jednom smjeru da prođe kroz izvor svjetlosti i poremeti ga na bilo koji način (ili npr fluorescira..) i onda se to detektira na zaslonu
Objasni princip spektrometrije masa (MS)
analitička metoda za razdvajanje ioniziranih molekula na osnovu razlike u omjeru mase i naboja (m/z)
princip: molekule uzorka se najprije ioniziraju, zatim u električnom polju ubrzavaju i uvode u odabirač brzine koji se sastoji od električnog polja i na njega okomito postavljenog magnetnog polja; kroz izlaz odabirača brzine mogu proći samo ioni određene brzine koja ovisi o omjeru jakosti električnog i magnetnog polja; ioni iste brzine kroz magnetno polje putuju zakrivljenim putanjama čiji se radijusi odnose kao njihove mase i konačno detektiraju na kolektoru koji se pomiče širinom polja (postoji i druga izvedba gdje se mijenja jakost napona ili magnetnog polja tako da ioni različitih masa imaju jednaku putanju (fiksni položaj detektora) pa se iz odnosa veličine napona pri kojima dolaze do detektora izračuna odnos njihovih masa)
