PCR

Question 1

¿De que depende el método de extracción para los análisis de ácidos nucleícos?

Answer 1

• Tipo de Ac. nucleico (ARN, ARNm, ARNr)
• Tipo de organismo (virus, procariota, bacteria)
• Tipo de muestra (sangre, suero, orina, LCR, semen)

Question 2

técnica fenol-cloroformo

Pasos para la extracción del ADN

Answer 2

1. Lisis de las cx. y liberación del ADN
   Lisis de eritrocitos→ cloruro de amonio (disuelve la membrana)
   Lisis de membranas celulares y nucleares → SDS (detergente que rompe membranas que el otro no puede)
2. Extracción de proteínas y lípidos con solventes (fenol-cloroformo)
3. Precipitación de ADN (solución salina saturada y etanol 100%)
4. Lavado de ADN (Etanol 70% y agua)

⬆️tarda + tiempo

Question 3

método de cuantificación de ADN

¿Cuál es la función de la espectrofotometría?

Answer 3

manda una longitud de onda de 260 nm y es captada por el ADN y el # que salga es la cantidad de ADN que hay en la muestra
(tiene que tener ⬆️ ADN y ⬇️ proteínas)

Question 4

método de cuantificación de ADN

¿Qué es la fluorometría?

Answer 4

Unión específica de colorantes fluorescentes (Hoechst 33258) en las 2 cadenas de ADN.
(entre + intensidad del colorante, va a tener + concentración de ADN)

Question 5

¿Qué significa PCR?

Answer 5

reacción de cadena de polimerasa (forma una cadena nueva de ADN=replicación)

se encarga de amplificar la presencia de un segmento

Question 6

se colocan en el tubito

¿Qué componentes se necesitan para realizar una PCR?

Answer 6

• Secuencia de ADN
• Enzimas ADN polimerasa (Taq=Thermus aquaticus)
• Desoxiribonuclleotidos (dNTP)
• Primers (cebadores)

Question 7

Tipos de desoxiribonucleótidos para PCR

Answer 7

dNTP
* dATP (adenina)
* dCTP (citosina)
* dGTP (guanina)
* dTTP (timina)

Question 8

¿Cuál es el pH necesario para que la ADN polimerasa funcione?

Answer 8

8.4

Question 9

Características de los primers para la PCR

Answer 9

• Se diseñan porque tienen que ser especificos para el antígeno que estamos buscando.
• Proporcionan un extremo 3’
• 2 TIPOS (Foward 5’-3’/ Reverse 3’-5’)
• Alto contenido de CG (para evitar que el primer no se despegue muy rápido porque tiene 3 puentes de H)

Question 10

¿Cuáles son los 3 procesos que se llevan a cabo dentro del termociclador?

Answer 10

• Desnaturalización
• Hibridación (alineamiento)
• Elongació (Extensión)

Question 11

Desnaturalización

Answer 11

• Se separan las cadenas de ADN
• Temperatura → 95° (20-30 seg)
• Nota: No hay una helicasa pero se sube la temperatura para romper los puentes de H

Question 12

Hibridación

Answer 12

• Los primers se alinean al extremo 3’
• Temperatura → 50°-60°
• ((4* G+C) + (2 * A + T)) → formula para obtener la temperatura exacta

Question 13

Extensión

Answer 13

• La Taq polimerasa comienza a poner los nucleotidos complementarios para crear la cadena nueva.
• Temperatura→ 72°

Question 14

¿Cuál es la temperatura a la que trabaja la Taq polimerasa?

Answer 14

72°C

Question 15

¿Cuántos ciclos se necesitan repetir en el termociclador?

Answer 15

35-40

Question 16

Se realiza después de los ciclos del termociclador

¿Qué es la electroforesis?

Answer 16

Técnica mediante la cual se separan las biomoleculas según su peso molecular en una disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.

Question 17

¿Cuáles son los elementos necesarios para una electroforesis?

Answer 17

• Cámara de electroforesis (genera un campo eléctrico alrededor del gel de agarosa. Tiene un polo + y uno -).
• Gel de agarosa (separa fragmentos de ADN que van de 100 pb a 25 kb)

Question 18

Características de la concentración de agarosa

Answer 18

• Se escoge según el tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar.
• El tamaño de los poros del gel depende de la concentración de agarosa (inversamente proporcional)
  Eg. (Entre + concentrada este la agarosa va a tener poros + pequeños)

Question 19

¿Qué es el marcador de peso molecular?

Answer 19

son una mezcla de moléculas de ADN o de proteínas de tamaño conocido que permiten determinar por comparación el tamaño de las moléculas (ADN o proteínas) contenidos en la muestra sometida a la electroforesis
Para ver cuantos pares de bases tiene la muestra para determinar si tiene el gen del antígeno que buscamos

Question 20

¿Cuál es el paso final para la interpretar los datos de una PCR?

Answer 20

colocar el gel de agarosa en un transiluminador ultravioleta

Question 21

¿Cuáles son los 5 tipos de pruebas PCR?

Answer 21

• PCR estándar (punto final)
• PCR múltiple
• PCR-restriction fragment length polymorphisms
• PCR- transcriptasa reversa
• PCR- tiempo real

Question 22

Función de una PCR estándar

Answer 22

Se encarga de la detección cualitativa de un segmento de ADN (presencia o ausencia)

Question 23

Función de la PCR múltiple

Answer 23

Busca la existencia de varios tipos de genes de antígenos en una sola muestra. (mete diferentes tipos de primers)

Question 24

Función de la PCR- RFLP

Answer 24

Utiliza enzimas de restricción para cortar el ADN. Detecta los polimorfismos genéticos

Question 25

Función de la PCR- transcriptasa reversa

Answer 25

Se utiliza para buscar ARN de un virus. Síntesis de ADN a partir de ARN mediante la enzima transcriptasa.

Question 26

Características de la PCR-tiempo real

Answer 26

* Cuantifica la cantidad de ADN de varios antígenos en una sola muestra. * Método + sensible para detectar y cuantificar los acidos nucleicos * Tarda menos tiempo

Question 27

¿Cuáles son los 2 tipos de colorantes utilizados en la PCR-tiempo real?

Answer 27

* **Especificos** → se crean **sondas** (secuencias complementarias de nt para un gen de interés) con colorantes fluorescentes que comienzan a brillar y es detectado por la computadora. * **No especificos** → es un colorante que se intercala cuando hay doble cadena para poder verlo, pero se une a cualquier parte por eso es inespecifico.

Question 28

¿Cuál es el tipo de PCR utilizada para detectar el COVID-19?

Answer 28

PCR en tiempo real y transcriptasa reversa