preparáty

Question 1

Typy preparátů

Answer 1

• Bazické anilínové barviva = vážou se na nukleovou kyselinu v jádře
  a. Nativní preparáty
  b. Trvalé preparáty

Question 2

Nativní preparát

Answer 2

• Neobarvené nativní preparáty se v bakteriologii příliš nevyužívají
• Nefixovaný preparát
• Nativní preparáty slouží hlavě k diagnostice parazitárních a mykotických infekcí
• V bakteriologii se nativní preparát využívá například pro pozorování pohybující se Treponema pallidum pomocí mikroskopie v zástinu
• Postup přípravy nativního preparátu je jednoduchý:
  
  • Na podložní sklíčko kápneme kapku fyziologického roztoku, do kterého kličkou vneseme vzorek
  • Následně to celé přiklopíme krycím sklíčkem (bez bublinek) a pozorujeme mikroskopem.

Question 3

Fixovaný barvený preparát

Answer 3

• K fixaci preparátu dochází před barvením (chemikálií, plamenem)
  1. Jednoduchý = methylenová modř (jestli tyčky/koky, jestli spóry)
  2. Diagnostické = uspořádání G+/G-
• Na sklíčko kápneme fyziologický roztok a do této kapky přidáme kličkou vzorek
• Celé to pak necháme zaschnout
• Nakonec připravený vzorek fixujeme pomocí plamene kahanu nebo například metanolem
• Účelem fixace je usmrcení bakterií a jejich pevné přichycení ke sklíčku, aby se při následném barvené nesmyly
• Barvení preparátů se provádí po fixaci vzorku
• Barvení jednotlivých struktur mikroorganismů nám ulehčuje jejich identifikaci
• Pro bakterie o velikosti několika µm se používá mikroskopie s imerzním objektivem s 1000x zvětšením pozorování
• Preparát na sklíčku zakápneme kapkou imerzního oleje, krycí sklíčko se nepoužívá
• Poté ponoříme objektiv do imerzního oleje
• Na konci pozorování je nutné očistit objektiv (buničinou navlhčenou benzinem)

Question 4

Barvení podle Grama - co to je

Answer 4

• Barvení podle Grama rozděluje bakterie na grampozitivní a gramnegativní
• Toto barvení je rychlé a jednoduché
• Principem je absorpce komplexu krystalové violeti s Lugolovým roztokem (roztok jodu v jodidu draselném) do bakteriálních buněk
• Rozdělení bakterií do dvou skupin je založeno na rozdílném vymývání tohoto komplexu organickým rozpouštědlem (acetonem) z bakteriální stěny
• Správnější název by tedy bylo Gramovo odbarvování
• K různému odbarvení dochází díky odlišné struktuře bakteriální stěny
• Bakteriální stěna obsahuje peptidoglykan murein
• Stěna gramnegativních bakterií je tenká, obsahuje velké množství lipidů
  o Tenká stěna umožňuje lepší průnik organického rozpouštědla a snadné vymytí komplexu krystalové violeti z bakterií
  o Proto se musí stěna dobarvovat karbolfuchsinem na růžovo
• Stěna grampozitivní bakterií je silnější a vrstevnatá
  o Silná stěna v sobě zadrží krystalovou violeť ve vazbě s jódem a nedochází k vymývání
  o Grampozitivní bakterie se díky krystalové violeti zbarví tmavě modře až modrofialově

Question 5

Postup barvení dle Grama: (vlak)

Answer 5

1. Připravíme si sklíčko = opálíme si z obou stran
2. Nakreslíme na sklíčko ovál tužkou + číslo vzorku
3. Opálíme nepopsanou stranu
4. Na opálenou nepopsanou stranu dáme kapku fyziologického roztoku a do ní dáme trochu bakteriální kultury
5. Necháme zaschnout
6. Poté rychle 3x zafixujeme nad plamenem
7. Na připravený fixovaný preparát kápneme krystalovou violeť a necháme ji působit (20 sekund)
8. Pak přidáme Lugolův roztok, který obsahuje jód (20 sekund)
9. Opláchneme vodou.
10. Poté aplikujeme aceton (20 rychlých sekund)
11. Opláchneme vodou
    - grampozitivní bakterie díky silné stěně zůstanou obarveny, gramnegativní bakterie se odbarví.
12. Nakonec přidáme karbolfuchsin pro kontrast a dobarvení (30 sekund)
13. Opláchneme vodou
    - grampozitivní bakterie poté zůstávají stejně barevné, gramnegativní bakterie se barví do růžova

Question 6

Barvení na ACIDOREZISTENCI (podle Ziehl-Neelsena)

Answer 6

• Barvení na acidorezistenci je určeno pro acidorezistentní bakterie rodu Mycobacterium tuberculosis (TBC) a Nocardia
• Tyto mikroorganismy se nebarví podle Grama kvůli buněčné stěně, která obsahuje lipidy s mykolovými kyselinami
• Tyto lipidy špatně absorbují barviva a musejí se proto barvit za horka
• Takto absorbovaná barviva se poté nedají vymýt ani odbarvením rozpouštědly s příměsí silných kyselin (acidorezistence) nebo zásad.
• Acidorezistentní bakterie jsou karbolfuchsinem obarveny růžově až červeně
• Kontrastní pozadí je zelené, bakterie růžové

Question 7

Barvení Fleming

Answer 7

• Barveni endospór
• Spóry = červené
• Tělo bakterie = šedé/bezbarvé

Question 8

Barvení podle Giemsy

Answer 8

• Používá se nejčastěji k obarvení krevního nátěru nebo fixovaného vaginálního stěru
• Znázorňují se prvoci, chlamydie, bakterie, mykoplazmata, virové inkluze, organely a buněčné struktury
• Zjištění např. MALÁRIE
• Hlavně v parazitologii
• Diagnostické barvení