Puce à protéine

Question 1

Différents types de puce

Answer 1

• Forward phase array
• Sandwich phase assay
• Reverse phase assay

Question 2

Forward phase array

Answer 2

• Protéines spécifiques fixées sur la lame

- Incubation avec échantillon biologique complexe (contenant protéines cibles)

Question 3

Sandwich phase assay

Answer 3

• Sondes de capture fixées sur lame (anticorps monoclonaux)
• Bloquage pour éviter fixation aspécifique
• Incubation échantillon biologique et capture de la protéine d’intérêt
• Lavage
• Ajout de sondes de détection (anticorps –> formation d’une structure en sandwich (3 couches)

Question 4

Reverse phase assay

Answer 4

• Echantillon biologique (contenant protéine cible) fixé à la puce
• Bloquage pour éviter fixation aspécifique
• Incubation avec protéine spécifique qui se fixe sur une protéine d’intérêt de l’échantillon

Application : Tests cliniques –> profil d’expression afin de montrer présence de marqueurs d’une pathologie

Question 5

Comment préparer protéines recombinantes ?

Answer 5

Expression protéine par transformation et purification.

Expression protéines in-situ

• PISA
• NAPPA
• DAPA

Question 6

PISA

Principe ?
Avantages ?

Answer 6

Protein In Situ Array.

• Dans une nanogoutte déposée sur lame, on a toute la machinerie transcriptionnelle/traductionnelle
• Ajout d’un ADN
• Synthèse protéine
• Protéine exprimée avec étiquette pour fixation sur la puce avec agent de capture

Avantages :

• Evite purification et dépôt
• Immobilisation et purification en une seule étape
• Intérêt pour protéines difficiles à exprimer (membranaires)

Question 7

NAPPA

Principe ?
Avantage ?
Inconvénient ?
Rendement capture ?

Answer 7

Nucleic ADN Programmable Protein Array.

• Dans une nanogoutte déposée sur lame, on a toute la machinerie transcriptionnelle/traductionnelle
• ADN biotinylée sous forme plasmidique s’accroche à la streptavidine fixée sur la lame
• Synthèse protéine
• Protéine exprimée avec étiquette pour fixation sur la puce avec agent de capture

Avantage : conservation puce ADN
Inconvénient : Interaction protéine / ADN
Rendement capture : 10 femtomole

Question 8

DAPA

Principe ?
Avantage ?

Answer 8

DNA array to Protein Array.

• Sandwich avec puce à ADN et puce avec agents de capture
• Entre les deux : membrane avec machinerie transcriptionnelle/traductionnelle

Avantage :

• une puce à ADN pour faire 20 puces à protéines
• évite interaction protéine / ADN

Question 9

Les différents supports ?

Answer 9

• Supports plans

- Supports non-plans

Question 10

Supports plans : lames ? caractéristiques ?

Answer 10

• lame de silice
• lame de verre :
  
  • activée
  • recouverte de nitrocellulose
  • recouverte d’hydrogel

Caractéristiques :

• surface doit être extrêmement lisse/plane
• densité uniforme des groupements chimiques

Question 11

Méthodes d’immobilisation des protéines ?

Answer 11

• Absorption
• Immobilisation covalente
• Capture par affinité
• Diffusion

Question 12

Absorption

Principe ?
Inconvénient ?

Answer 12

Interaction non covalente :

• surfaces hydrophobes (nitrocellulose et polystyrène)
• surface chargée positivement (poly-L-lysine et aminosilane)

Inconvénient : Fixation avec orientation aléatoire

Question 13

Immobilisation covalente

Principe ?
Avantages ?

Answer 13

Utilisation des amines primaire des lysines.

Couplage avec l’amine :

• lame fonctionnaliser avec COOH
• EDC réagit avec COOH –> intermédiaire amine réactif instable
• ajout NHS –> stabilisation intermédiaire en donnant ester NHS amine-réactif
• fixation covalente de la protéine par amine de lysine

Réaction Diels-Alder :

• lame d’or où il y’a autoassemblage des monocouches d’alkanethiolate
• alkanethiolate liée à groupement oligo éthylène glycol –> empêche adsorption aspécifique
• groupement oligo éthylène glycol lié à benzoquinone
• benzoquinone qui réagit avec cyclopentadiène (fixée à la protéine) par réaction Diels-Alder

Avantages :

• plus efficace et reproductible
• Diels-Alder : éloigne protéine du support

Question 14

Capture par affinité

Avantage ?

Answer 14

• Protéine d’intérêt en fusion avec étiquette (ou sans étiquette)
• Lame fixée avec protéine à forte affinité pour l’étiquette (ou affinité avec l’anticorps)

Avantage : orientation uniforme

Question 15

Diffusion

Answer 15

Puce avec hydrogel : protéine diffuse dedans

Question 16

Dépôt des protéines ?

Inconvénient ?

Answer 16

Par des robots :

• Mode contact
• Mode non contact
• A flow continu

Lithographie :

• DIP-PEN nanolithographie
• Nanolithographie électronique

Inconvénient : adsorption aspécifique –> utilisation de BSA ou lait écrémé pour la caséine

Question 17

Mode contact

Principe ?
Volume ?

Answer 17

• aiguille avec canal à l’intérieur pour mettre échantillon
• l’aiguille a une tête plate qui permet formation couche mince d’échantillon à l’extrémité de la pointe
• application sur la lame : mécanisme de tampon ancreur / impression

Volume : 0,25 uL

Question 18

Mode non contact

Principe ?
Volume ?
Avantage ?

Answer 18

Echantillon déposé sans contact sur la surface

• vaporisation de l’échantillon avec des micro-gouttelettes (par jet d’encre, pulsation piézoélectrique ou électrospray)

Volume : centaine de pL

Avantage :
- évite d’endommager optique de la puce : pratique pour SPR car réseau optique proche de la lame

Question 19

A flow continue

Principe ?
Volume ?
Avantages ?

Answer 19

Technologie qui utilise va et vient pour faire circuler la solution de protéine sur une zone bien précise.

Volume : bine plus bas que contact et non contact

Avantages :

• possibilité d’utiliser des solutions plus diluées
• aucune contamination des spots à proximité
• peut faire modification chimique sur le spot car on peut faire circuler ce que l’on veut

Question 20

Dip-pen nanolithographie

Principe ?

Avantage ?

Answer 20

• stylo avec une pointe d’un microscope à force atomique
• l’encre c’est la solution biologique que l’on veut déposer
• en déplaçant la pointe sur la lame, formation d’un ménisque d’eau et les molécules se déposent
• l’écriture est séquentielle (pixel par pixel)

Avantage :

• peut faire multiplexage (déposer plusieurs protéines sur même support)
• on peut travailler dans des conditions ambiantes
• diminution volume échantillon

Question 21

Nanolithographie électronique

Principe ?
Avantage ?

Answer 21

Application d’impulsion de potentiel entre une pointe métallisée d’un AFM et la couche métallique (support)

Avantage :
- en une seule étape

Question 22

Détection : différentes façon de faire marquage

Answer 22

• Marquage direct : toutes les protéines dans un échantillon sont marquées
• Marquage indirect : anticorps secondaire marqué
• Marquage Immunotest en sandwich avec deux anticorps : protéine intérêt fixé en sandwich puis ajout anticorps secondaire marqué

Question 23

Différentes façon de détecter ?

Answer 23

• Fluorescence
• Radioactivité
• Résonance Plasmonique de Surface
• Microscopie à Force Atomique
• Spectrométrie de masse

Question 24

Fluorescence

Principe ?
Modes d’analyse ?
Augmenter sensibilité ?

Answer 24

Utilisation marqueur fluorescent.

Deux mode d’analyse :

• capture d’un instantané avec caméra CCD (Charged Coupled Device)
• lecture de la puce point par point à l’aide d’un tube photomultiplicateur

On peut augmenter sensibilité de détection de 3 façon :

• Guide d’onde planaire
• Nanocristaux
• Amplification d’ADN circulaire

Question 25

Guide d'onde planaire Principe ? Structure ? Limite détection ? Avantage ?

Answer 25

- support en verre ou plastique transparent - on le recouvre d'une couche de guidage qui permet à l'onde d'être guidé - la puce est sur la couche de guidage - création d'un champ évanescent au-dessus de la couche de guidage - la lumière se cantonne aux 100 premiers nanomètres à la surface de la puce - excitation sélective des fluorophores situées dans les 100 nanomètres au-dessus de la puce Structure : tantalum pentoxide (Ta2O5) Limite détection : 0,8 zmol Avantage : - améliore le rapport signal/bruit

Question 26

Nanocristaux ``` Principe ? Constitution ? Limite détection ? Avantages ? Applications ? ```

Answer 26

- cristaux semi conducteurs de dimension nanométrique - présentent des propriétés de fluorescence que l’on peut moduler en contrôlant leur diamètre Constitution : - coeur en Sélénure de Cadmium - coquille de Sulfure de Zinc - revêtement de polymères hydrophiles - on peut recouvrir l'extérieur avec composés biologiques Limite détection : 0,4 fmol Avantages : - multiplexage - plus brillant : meilleur rapport signal/bruit - durée de vie fluorescence plus longue qu'organique - résiste au photoblanchiement - large déplacement de Stokes Applications : - quantification miARN - tester des protéases : particules d'or fixée à protéine fixée à nanocristaux recouvert de streptavidine pour se fixer à la lame. Absence de fluorescence des nanocristaux par FRET avec Or. Si protéase coupe protéine, libération particule d'Or et libération de la lumière.

Question 27

Amplification d'ADN circulaire Principe ? Inconvénients ?

Answer 27

- oligonucléotide pré-annelé avec séquence ADN circulaire modèle - fixation d’un oligonucléotide à un anticorps anti-biotine - biotine fixée à un anticorps qui reconnait protéine d'intérêt sur puce - allongement de l'oligonuléotide de l'anticorps via l'ADN circulaire modèle par une ADN polymérase - hybridation de l’oligonucléotide avec courts oligonucléotides fluorescents qui apportent de très nombreux fluorophores - augmente la sensibilité de la détection Inconvénients : - limité par la catalyse enzymatique - calculer les rapports pour déterminer concentration des réactifs à ajouter

Question 28

Radioactivité Principe ? Application ?

Answer 28

Molécules marquées au 32P, 33P ou au 14C. Permet de détecter les évènements de phosphorylation de protéine et d’acétylation. Utilisation de micropuits pour faire l'étude des activités enzymatiques : - met les protéines substrats dans les puits avec des kinases par exemple - si kinase reconnait la protéine, incorporation de la radioactivité - lavage - si puits avec radioactivité = protéines phosphorées avec kinase Application : élaboration réseau global de protéines pouvant être phosphorylé

Question 29

Résonance Plasmonique de Surface Principe ? Application ?

Answer 29

- faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre 2 milieux d’indice de réfraction différent - l’angle d’incidence est tel que toute la lumière incidente peut être réfléchie (pas de réfraction) - changements de masse, induit par l’association ou la dissociation des complexes avec les agents de capture fixés sur la lame, modifient l’indice de réfraction du milieu et décalent la position de l’angle de résonance Application : - caractériser interaction

Question 30

Microscopie à Force Atomique Principe ? Application ?

Answer 30

Détection de la fixation d’anti-IgG de lapin immobilisées sur une surface d’or par mesure de l’augmentation de hauteur. Application : - Détecter la présence de pathogènes : anticorps fixé à la puce. Si fixation par pathogène, élévation de la hauteur du spot.

Question 31

Spectrométrie de masse Principe ? Application ?

Answer 31

Analyse des masses des protéines capturées sur la puce. Application : - comparaison urine avant et après traitement