1
Q
Hoe ontstaat leukemie?
A
- als bij incorrect schadeherstel cellen niet dood gaan treden mutaties op gevolgd door transformatie.
- Leukemie ontstaan uit 1 gemuteerde cel.
- helft microscopisch zichtbaar(translocaties)
2
Q
Wat is het Philadelphia chromosoom?
A
- 95% gevallen CML heeft translocatie t(9;22)
- breuk altijd in zelfde intron gebieden
- chromosoom 22 word korter = Philadelphia chromosoom
- BCR-ABL fusiegen geeft groeivoordeel
- fusie-eiwit p210 BCR-ABL
3
Q
Wat gebeurt er als CML niet behandeld word?
A
Overgang acceleratie(chronische) naar blasten(acute) fase. Hierbij ontstaan andere mutaties en chromosoom afwijkingen.
4
Q
Hoe werkt de behandeling van CML?
A
- p210 BCR-ABL eiwit: imatinib bind in pocket waar ATP bind, waardoor blokkering functie
- imatinib resistentie: mutatie Abl1 gedeelte, pocket bind geen imatinib maar wel ATP
- als tyrosine kinase remmers niet werken kan stamceltransplantatie
5
Q
Hoe kunnen patiënten met AML onderverdeeld worden?
A
- obv cytogenetische afwijkingen
- goede prognose: translocatie t(8;21) en t(5;17)
- slechte prognose: chromosoom 7 afwijkingen
6
Q
Welke fasen zijn er in de celcyclus?
A
- Interfase
- G1: celgroei
- S: verdubbeling DNA → 2 chromatiden per chromosoom
- G2: klaarmaken v mitose
- M(mitose)-fase: verdeling chromosomen over dochtercellen
7
Q
Welke fasen zijn er in de mitose?
A
- Profase: condenseren DNA, chromosomen zichtbaar
- Prometafase: kernenvelop weg, chromosomen aan microtubuli
- Metafase: chromosoom midden in cel= metafase plaat
- Anafase: chromosomen uit elkaar naar polen
- Telofase: DNA decondenseren, kern terug
- Cytokinese: verdeling cytoplasma over 2 cellen
8
Q
Wat zijn centrosoom, centromeer en kinetochoor?
A
Centromeer= centrale deel chromsoom
Centrosoom= 2 loodrecht op elkaar staande centriolen, verdubbelen in S fase en tijdens mitose tegenover elkaar bij polen
Kinetochoor= eiwitstructuur die tubuline draden(microtubuli/spoelfiguur) uit centrosoom starten aan chromosomen vastzitten(thv centromeer)
9
Q
Hoe kun je chromosomen bekijken?
A
- alles aankleuren: bandering
- in situ hybridisatie(FISH): gen aankleuren m fluoroscerende probe(enkelstrengs mactend DNA)
- chromsoom specifieke probes(FISH): verzameling probes toevoegen om chromosoom aan te kleuren
10
Q
Wat voor soort structurele chromosomale afwijkingen zijn er? Hoe ontstaan ze en wat is het gevolg?
A
- start met dsDNA breuk door hele cyclus ontstaan
- Deleties: geen reparatie, in mitose stuk chromosoom niet verdeeld ⇒ mirconucleoli
- Chromothripsis= 1 of meer chromosomen breken in kleine stukjes en weer aan elkaar gezet -> transversies
- Translocaties: verkeerde reparatie
- Dicentrische chromosomen: 2 centromeren in een chromosoom, in metafase 2 kanten op getrokken → breuk
11
Q
Hoe ontstaan numerieke chromosomale afwijkingen?
A
In metafase chromosoom niet vast voor verdeling in anafse, waardoor non-dysjunctie -> chromosoom duplicatie of verlies
12
Q
Wat is de functie van telomeren?
A
- voorkomen genomische instabiliteit: lijkt op dsDNA breuk, T-loop voorkomt NHEJ en vorming dicentrische chromosomen
- beperken celgroei: na elke celdeling korter, als te kort apoptose
13
Q
Hoe werken telomeraseremmers?
A
- telomerase revrse transcriptase verlengt bij stamcellen telomeren zodat blijven delen
- 90% tumorcellen brengen telomerase tot expressie
- andere deel gebruikt ALT-mechanisme
- telomerase kan tumorgroei beperken, maar tumorcellen kunnen het ALT-mechanisme aanzetten of mutatie telomeren
14
Q
Wat zijn cyclines?
A
controleren voortgang celcyclus d activering CDK enzymen
- cycline A: progressie S-fase
- cycline B: overgang G2-M
- cycline D: activatie celcyclus in G1 na groeisignaal
- cycline E: overgang G1-S fase en progressie S-fase
15
Q
Wat zijn cycline afhankelijke kinases(CDK)?
A
- fosforyleren eiwitten voor progressie celcylus
- altijd aanwezig
- actief als complex met cyclines
CDK2: cycline E en A
CDK4: cycline D
16
Q
Wat zijn cycline afhankelijke kinase remmers(CKI)?
A
- binden aan cycline/CDK complex, remt kinase activteit
- G1 fase: p16 remt CDK4
- na DNA schade
P21 remt CDK2
17
Q
Welke checkpoints zijn er in de celcyclus?
A
- restrictiepunt: delen of differentieren -> RB
- G1/S: DNA beschadigd -> P53
- intra S: DNA beschadigd -> ATM
- G2/M: DNa beschadigd, DNA replicatie juist verlopen
- anafase: chromosomen verbonden met microtubuli -> BUB1(spanningsgevoelig eiwit)
18
Q
Hoe werkt het restrictiepunt?
A
- E2F is inactief als aan pRB gebonden
- cyc D/CDK4 fosforyleert RB
- E2F vrij en actief als transcriptiefactor
- activatie cycline E
- p16 remt cyc D/CDK4
19
Q
Hoe werkt het G1/S checkpoint?
A
- p53 is tumorsuppresorgen
- bij DNA schade stijgt niveau
- p21 actief -> cyc E/CDK2 geremd -> G1/S arrest
- opruimen DNA beschadiging
- bij mutatie p53 replicatie beschadigd DNA en mutaies
20
Q
Wat is ataxia telangiecstaisa(AT)?
A
Overgevoeligheid rontgenstraling, kanker predispositie en progressieve ataxie
Defect in ATM gen, waardoor geen CHK2 dat CDK2 remt
Radioresisent DNA synthese(RDS) fenotype: na bestraling DNA schade, 3H-thymidine toch ingebouwd in S-fase
21
Q
Wat is het Nijmegen breuk syndroom(NBS)?
A
- microcefalie, groeiachterstand, chromosomale instabiliteit, stralingsgevoeligheid en kanker predispositie
- autosomaal recessief mutatie Nbs1/RAD50
- binden aan dsDNA breuk en houden bij elkaar -> translocaties
- RDS fenotype: geen activatie ATM kinase
22
Q
Wat is het verschil tussen gebalanceerde en niet-gebalanceerde structurele chromosomale afwijkingen?
A
Bij een gebalanceerde afwijking(translocatie, inversie en insertie) is er geen verlies van materiaal, bij een niet-gebalanceerde(deletie, amplificatie, nb translocatie en genmutatie) kan er materiaal bijkomen of verloren gaan.
23
Q
Hoe werkt FISH?
A
- fluroscerende probe(stuk enkelstrengs DNA) hybridiseert met gedenatureerd DNA patient
- metafase bij gekweekt/delende cel, interfase bij niet delende cellen
- snel, maar beperkte sensitiviteit en targets
Fusie probes: translocatie via fusie-signaal, risico co-localisatie
Break-apart probes(als telkens zelfde gen betrokken): als normaal 2 fusies, bij translocatie 1 fusie en 2 kleur signalen
24
Q
Hoe werkt SNP-array?
A
- ongebalanceerd: deleties en duplicaties
- Allel A en B vers kleuren(1 nucleotide op chromosoom anders) -> combi’s
- LogR: maat aantal kopieën
- B-allele frequentie: hoe vaak komt SNP voor
Normaal: LogR(0)=2, allel frequentie AA, AB en AA
25
Hoe kweek je materiaal bij cytogenetisch onderzoek?
bloed of beenmerg in kweekmedium m GF → na 1/2dg mitose blok(mbv colcemid, geen spoeldraden) → na half uur hypotoon oplossing(cel zwelt) en fixatief → op glaasje, membraan valt open
26
Hoe werkt de intracellulaire moleculaire oscillator?
- klok genen werken in positieve en negatieve feedback loops
- klok gecontroleerde genen koppelen moleculaire klok aan output processen(metabolisme, fysiologie en gedrag)
- snelheid is bepalend voor chronotype(ochtend/avondmens)
27
Hoe werkt de circadiane klok?
- ritme duurt 24h
- centrale klok in neuronen SCN: gesynchroniseerd m dag/nacht-ritme via licht-resetting in oog
- perifere klokken in andere cellen en weefsels: gesynchroniseerd m centrale klok via hormonen/neuronale stimuli uit SCN
- 20% genen onder controle oiv circadiane klok, activiteit varieert door dag
- geeft tijdstructuur aan lichaam
28
Wat is chronotherapie?
Het toedienen van chemotherapie op het moment dat zo min mogelijk gezonde cellen beschadigd worden -> minder bijwerkingen en mogelijk effectiever
- tumorcellen zijn op elk moment even gevoelig
29
Hoe zijn de celcyclus en de circadiane klok gekoppeld? Hoe kan dit bij tumorcellen afwijken?
Bidirectioneek: fasen celcyclus worden gestart op bepaald moment dag en circadiane klok gerest door celcyclus
- intact, maar ontkoppeling van celcyclus
- gekoppeld, maar geen respons op synchorniserende signalen
- geen circadiane klok
30
Waarom is mRNA niet een goede maat voor voorspellen v/d eiwit(activiteit)?
Er zijn veel regulatiemogelijkheden in processen van DNA naar actief eiwit
31
Hoe kun je eiwitten identificeren met massa-spectometrie?
- trypsine knipt op arginine en lysine -> tryptische fragmenten
- analyse m massa-spectometrie
Elk peptide krijgt positieve lading -> afgestoten van positieve elektrode, negatieve platen versnellen d vaccuumbuis -> detector
Intensiteit en massa/lading
- vergelijken data met humaan genoom
- idetificatie
32
Hoe kun je een eiwit-interacties en modificaties identificeren?
Immuunprecipitatie= isoleren eiwit met antilichaam dat eiwit herkend en vast zit aan onoplosbaar bolletje, rest wegwassen -> massa-spectometrie
Modificatie: verrijking voor fosfopeptiden na trypsine digestie -> 2 pieken kort na elkaar op massa-spectogram
33
Wat is metabolomics?
Analyseren welke metabolieten voorkomen in bv bloed m massa-spectometrie -> biomarker?
34
Hoe werkt RNA interferentie en gene silencing?
- MicroRNA’s gecodeerd in DNA -> Drosha(kern) en Dicer(cytoplasma) knippen -> inbouw in RISC -> regulatie translatie
- siRNA’s: komen voor in DNA -> dicer maakt silencing RNA’s, binden aan RISC -> bind aan target mRNA -> knippen en afbreken mRNA -> genexpressie minder
Gebruiken om expressie essentiële eiwitten groei tumorcel te remmen
35
Waaruit bestaat het humaan genoom?
- nuclear genoom: DNA in celkern, haploid
- mitochondriaal genoom: 1% tot, circulair, enzymen en rRNA
- grootte is niet bepalend v complexiteit
36
Wat zijn algemene kenmerken v/h humane genoom?
- Klein deel genoom zijn eiwit-coderende genen
- RNA-only genen: functie onbekend
- proteoom(alle gecodeerde eiwitten( is complexer dan invertebraten
- 1,5% genoom zijn exonen, meeste genen hebben veel grote introns → 1/3 genoom gentranscribeerd
- Helft genoom bestaat uit hoog repetitief DNA uit transposabele elementen(= in genoom terecht gekomen, kunnen vermenigvuldigen en op andere plek in genoom gaan zitten)
- Transposon activiteit elementen weg
37
Hoe werkt een cDNA microarray?
- vergelijken tumoren met gezond weefsel
- RNA isoleren → labelen → mengen en hybridiseren als tot expressie
- Gen tot expressie: even hoog=geel, als een hoger rood(tumor hoger) en blauw(alleen normaal)
- Data verwerking en interpretatie mbv bioinformatica(clustering)
- Valideren met microarray data: western blot/RT-qPCR
- Genen en moleculaire processen → functionele analyse, verbeterde diagnose en prognose + individuele behandeling
38
Wat doet paclitaxel? Wat zie je op flow cytometrie?
Bind aan tubuline, waardoor microtubli niet kunnen depolymeriseren en cellen geen vrij tubilne hebben om nieuwe microtubuli te maken
Cellen vast in anafase
39
Hoe werkt FACS?
- Kwantificering DNA-gehalte
- Cellen in kweek/weefsel zijn asynchroon(niet zelfde aantal)
- Kleuring d fluorescent DNA-bindend molecuul: propidium iodide(PI)
- Hoe meer fluorescentie, des te meer DNA
- Flow cytometer: scheiden en analyseren cellen
- Y-as: aantal cellen; x-as: intensiteit signaal, proportioneel met intensiteit
- In delende cellen: 3 pieken
- A: G1-fase
- B: S-fase
- C: G2-fase
40
Hoe werkt immunokleuring met phospho-huston H3 en geminin? En EdU?
- Solide tumoren hebben geen losse cellen → geen FACS
- Kleuringen
- HE
- Phospho-histon H3: specifiek mitose
- Geminin/cycline: S/G2
- ingebouwd in DNA ipv thymidine, aantonen m reactie
- Pas aan eind behandelig toegevoegd: anders verschil tussen cellen in vers fasen celcyclus niet zien
41
Hoe werkt aphidicolin? Wat zie je op Flow cytometrie?
- DNA polymerase remmer
- Flow cytometrie na 15h: alle cellen die niet in S-fase zijn niet gevoelig, geen complete remmer → piek bij 1, loop af naar 2
