1
Q
quelles sont les roles des proteases ?
A
-digestion
-clivage des precurseurs hormonaux
-clivage des precurseurs viraux
-coagulation du sang
-degradation des proteines cellulaires
2
Q
que font les proteases ?
A
elles hydrolysent le lien peptidique ou le lien ester
3
Q
endopeptidase ?
A
rompent les liaisons internes donc hydrolyse limitée
4
Q
exopeptidase ?
A
clivent les liens peptidides N- ou C- terminal
donc coupent a l’exterieur
degradation complete
5
Q
exemple d’endopeptidase ?
A
-Chymotrypsine
-Trypsine
6
Q
exemple exopeptidase ?
A
N -> aminopeptidase
C -> carboxypeptidase
7
Q
6 grandes familles de protéases
A
- Ser
-Cys
-acide aspartique
-metalloprotease
-acide glutamique
-Thr
8
Q
site catalytique
A
contient les residus qui font la reaction chimique
9
Q
site specificité
A
region ou se fixe le substrat
10
Q
pour la nomenclature a quoi corrrespond le P et le S
A
P : aa
S : sous sites
11
Q
les aa du coté carboxyle (gauche)
A
P1; P2; P3
11
Q
les aa du coté hydrolysé (droite)
A
P1’ ; P2’ ; P3’
12
Q
quels sont les aa de la chymotrypsine ?
A
-Thr
-Tyr
-Phe
-Met
13
Q
que fais la chymotryspine ?
A
La chymotrypsine est une enzyme digestive du pancréas qui dégrade les protéines en fragments plus petits pour faciliter leur absorption.
14
Q
ou coupe la chymotrypsine ?
A
P1S1 et demande des aa particulier avec un sous site hydrophobe
15
Q
Serine 1 représentants
A
Trypsine, Chymotrypsine, Élastase
16
Q
Acide asp représentants
A
Penicillopepsine
16
Q
Cysteine représentants
A
Papaïne
16
Q
Serine 2 représentants
A
Subtilisine
17
Q
Metallo 1 représentants
A
Carboxypeptidase A
18
Q
Metallo 2 représentants
A
Thermolysine
19
Q
serine 1 residus au site catalytique
A
Asp102, Ser195, His57
20
Q
Serine 2 residus au site catalytique
A
Asp32, Ser221, His64
21
Q
cysteine residus au site catalytique
A
Cys25, His159, Asn175
22
acide asp residus au site catalytique
Asp33, Asp213
23
metallo 1 residus au site catalytique
Zn, Glu270, H2O
24
metallo 2 residus au site catalytique
Zn, Glu143, His231
25
c'est quoi le substrat ester utilise pour la chymotrypsine ?
PNPA
26
combien il ya d'etape pour l'hydrolyse du PNAP ?
2 avec une etape intermediaire
27
explique toutes les etapes de l'hydrolyse du PNAP
- Le groupe phenyl du PNAP imite le groupe de molecule enzymatique que l'enzyme recherche
- l'enzyme va donc cliver un bout ( elle s'attache a l'autre bout en contre partie et donc pour ce detacher elle a besoin d'une molecule d'eau)
-quand l'enzyme coupe le faux substrat ca libere du P-nitrophenolate qui est assez jaune et donc facile a voir
28
a quoi correspond la porducton lente des produits lors de la phase stationnaire ?
ca correspond a la vitesse limitante de la reaction
29
comment on peut definir la concentration initiale d'enzyme active ?
| comment...
en regardant l'extrapolation au temps zero
30
si il ya une extrapolation au temps zero de 0,63 mol de p-nitrophenolate ca veut dire quoi ?
Soit que la forme active de l’enzyme est pure à 63%, soit que la constante de formation de l’acyl-enzyme n’est pas beaucoup plus grande que la constante de déacylation et ne permet pas à l’acyl-enzyme de s’accumuler entièrement.
31
a quoi correzpsond le KM
a l'affinité
KM haut affinité basse
31
a quoi correspond le Kcat ?
le nombre de molécules de substrat transformées en produit par
unité de temps et par site actif, lorsque l’enzyme est saturé par le substrat
32
qu'est ce qu'on regarde pour voir l'efficacité d'une enzyme ?
on regarde le ratio Kcat/KM
33
a quoi correspond V0
1/2 Vmax
34
K2
constante de vitesse d'acylation
34
a quoi sert l'hydrolyse du PNPA ?
la liberation du p-nitrophénolate
34
K3
constante de vitesse de déacylation
35
dans l'hydrolyse du PNPA a quoi sert la SER195
Dans l’hydrolyse du p‑nitrophenyl acetate (PNPA) par la chymotrypsine, Ser195 est le nucléophile principal.
L’oxygène de Ser195 attaque le carbone carbonyle du PNPA. Cela forme un intermédiaire tétraédrique.
36
DFP
inhibiteur de proteases a serine comme la chymotrypsine il degrade egalement l'acetylcholine
37
a quoi sert le DFP
Le DFP sert principalement à identifier les enzymes qui utilisent une sérine dans leur site actif.
38
quel est le seul residus de la chymotrypsine qui reagit avec le DFP
la Ser195
39
quel est le gaz qui agit comme le DFP ?
Le gaz sarin, inhibiteur mortel de l’acétylcholinésterase.
40
quels sont tous les inhibiteurs de protases serines ?
- DFP
-PMSF
-AEBSF ( mieux que le PMSF)
-TPCK
41
quels sont les defaux du PMSF ?
il n'est pas soluble dans l'eau et est toxique
42
triade catalytique
| proteases a serine
Asp102 → stabilise His57
His57 → déprotone Ser195
Ser195 → attaque le substrat
43
comment agit le TPCK ?
Le TPCK ressemble à un substrat aromatique de la chymotrypsine (car il contient une phénylalanine).
L’enzyme le reconnaît et le place dans son site actif.
Le groupe chlorométhylcétone réagit ensuite de façon covalente avec une histidine du site actif.
vu qu'on a touché a l'histidine de la triade catalytique, l'enzyme ne marche plus
44
comment la triade catalytique tient ?
La conformation de ces trois résidus est stabilisée par une série de liaisons
hydrogène: Ce réseau de
liaisons hydrogène augmente le caractere nucléophile de la Ser195.
45
que modifie le DFP et le TPCK
DFP → modifie Ser195.
TPCK → modifie His57.
46
c'est quoi la mutagenèse
Elle sert à comprendre le rôle d’un acide aminé dans une protéine ou une enzyme.
47
par quoi est formé la poche oxyanion
Ser195
Gly193
48
comment on a trouvé le role de l'Asp102
Le rôle de l’Asp102 a été vérifié par mutagenèse dirigée. On a remplacé l’Asp102 par un résidu isostérique non chargé: l’Asn.
49
def mutagenese dirigée
mutation volontaire d’un acide aminé.
49
c'est quoi Poche de l’oxyanion
Structure importante du site actif qui :
stabilise l’intermédiaire tétraédrique
stabilise l’état de transition
50
phase acylation
1: Substrat se fixe dans la poche hydrophobe.
2 : Ser195 attaque le carbonyle du substrat.
Formation :
➡ intermédiaire tétraédrique.
3 : Produit amine libéré.
Formation de :
➡ acyl-enzyme
51
phase deacylation
4 : Liaison d’une molécule d’eau a l'intermediare acyl-enzyme
5: His57 active l’eau.
Formation d’un intermédiaire tétraédrique.
6 : L’intermédiaire tétraédrique est converti en produit. Cette conversion est facilitée par une catalyse acide de l’His57
7 : Produit carboxylate libéré.
Enzyme régénérée.
52
mecanisme ping-pong avec chymotrypsine
Substrat 1 : la protéine
→ formation d’un acyl-enzyme
Substrat 2 : eau
→ hydrolyse de l’acyl-enzyme
Étapes :
la protéine est coupée → premier produit libéré
l’enzyme reste acylée
l’eau attaque → deuxième produit libéré
53
chymotrypsinogène
le zymogène (forme inactive) de la Chymotrypsine.
53
l’églin C
L’églin C est un inhibiteur naturel de proteases serines provenant d’une sangsue.
Elle agit comme :
un inhibiteur compétitif
réversible
non covalent
54
que se passe t'il dans la digestion ?
La Trypsine est d’abord activée à partir du Trypsinogène par l’Entéropeptidase dans le duodénum.
Une fois activée, la trypsine active les autres zymogènes pancréatiques, comme le Chymotrypsinogène, la proélastase et la procarboxypeptidase.
Cette activation doit être strictement contrôlée pour éviter que les enzymes digestives s’activent dans le pancréas, ce qui pourrait causer des dommages graves comme une Pancréatite aiguë.
55
quel est le seul inhibiteur de la chymotrypsine qui a des liaisons non-covalente ?
Eglin C
56
def zymogene
Ils servent à empêcher qu’une enzyme soit active trop tôt, ce qui pourrait endommager les cellules ou les tissus.
57
qu'est ce qui se passe si on ajoute de la trypsine a un melange de substrats ?
La trypsine hydrolysera de préférence les liens peptidiques Lys-AA et Arg-AA. On dit que la trypsine est spécifique pour Lys et Arg en position P1 du substrat.
58
c'est quoi la specificité de la chymotrypsine, de la trypsine et de l’élastase
exprimée par la nature de l’acide aminé en position P1 d’un substrat.
59
residu prefere en P1 pour chymotrypsine
Phe, Tyr, Trp
60
residu prefere en P1 pour trypsine
Lys, Arg
61
residu prefere en P1 pour elastase
Gly, Ala
62
Entre la chymotrypsine, de la trypsine et de l’élastase quelle enzyme a la poche la plus profonde ?
LA trypsine suivi de la chymotrypsine et enfin l'elastase
63
comment on mesure l’activité des protéases
grâce à des substrats fluorescents “quenched”
63
Abz
donneur
64
Dnp
accepteur
65
comment analyser le quenched et donc savoir si la proteases marche ?
Quand le peptide est intact. Le donneur et l’accepteur sont très proches. L’énergie du donneur est transférée à l’accepteur (FRET). La fluorescence est faible ou éteinte.
Quand la protéase coupe le peptide. La liaison peptidique est clivée. Le donneur et l’accepteur se séparent. Le transfert d’énergie ne se fait plus. Resultat : La fluorescence augmente.
66
qu'est ce qu'on a entre le Abz et le Dnp ?
X : melange équimolaires de 20 aa
Z : aa fixes connus
67
est ce que toutes les cathepsines sont des proteases a cysteines ?
Non , nous avons les A D E et G qui ne le sont pas
68
c'est quoi les caspases ?
protéase à cystéine qui coupe après un résidu aspartate.
69
Van’t Hoff
/\GS = - RTlnKS
avec t pour la temperature et R pour la constante universelle de gaz
70
le ration Kcat et Km represente 2 choses, lesquelles ?
𝑘cat/𝐾M représente la constante de spécificité mais aussi la constante de vitesse pour la réaction de l’enzyme libre avec le substrat.
71
c'est quoi des calpaïnes ?
protéases à cystéine qui sont activées par le calcium.
72
c'est quoi des USP ?
protéases spécifiques de l’ubiquitine, ce sont des enzymes qui enlèvent l’ubiquitine des protéines.
73
Maladies osseuses (ostéoporose)
cathepsine K
74
Formation de métastase
cathepsines B, L
75
Arthrite rheumatoïde (dégradation du cartilage articulaire)
cathepsines B, K
76
Emphysème (maladie chronique des poumons où les petits sacs d’air appelés Alvéoles pulmonaires sont abîmés ou détruits.)
cathepsines C, S, K
76
Maladies du système immunitaire (asthme, rejet de transplantation)
cathepsines C, S, L(V)
77
Maladies génétiques (rares)
Pycnodysostose
Syndrôme Papillon-Lefèvre
Epilepsie myoclonique progressive de type Unverricht- Lundborg
cathepsine K cathepsine C
cystatine B (inhibiteur de cathepsine – surtout B, L, S)
78
Dégradation des protéines (housekeeping enzymes)
cathepsines B, C, H, L
78
Préparation d’antigènes / decoupage de proteines
cathepsines B, L, H
79
Dégradation des chaînes légères des anticorps
cathepsines S, L (cathepsines V, F)
80
Rôle de régulation
(Activation des pro-enzymes dans les cellules immunitaires)
cathepsine C
80
Résorption osseuse
(Dégradation de la matrice de collagène de l’os -espace extracellulaire dans les ostéoclastes)
cathepsine K
81
de quoi est formé la papaïne
- 212 aa
- 3 ponts disulfure
82
quel est l'inhibiteur des cathepsines ?
c'st le E64, il va se lier de maniere convalnete et irreversible a l'atome de soufre de la cysteine et une fois accroché le ciseaux ne peux plus marcher
82
explique la triade catalytique pour la papaïne
- Cys25
- His159
- Asn175
83
a part le E64 quel est l'autre inhibiteur de cathepsines ?
l’iodoacétate.
84
quelle est la difference entre les proteases a cysteines et a serine concernant le nucleophile ?
le groupement nucléophile est fourni par une Cys au lieu d’une Ser.
85
explique le mecanisme en 3 etapes des proteases a cysteine
-L’anion thiolate de la cys 25 attaque le carbone du groupe carbonyle du substrat pour produire un intermédiaire tétraédrique.
-L'intermédiaire tétraédrique est transformé lentement en intermédiaire acyl- enzyme grâce au cation imidazolium de l’his 159 qui joue le rôle d’acide et donne un proton au groupe partant pour former P1. (ETAPE LIMITANTE)
-Ensuite, l’intermédiaire acyl-enzyme est hydrolysé rapidement pour donner P2 et régénérer la forme active de l’enzyme.
86
DONNE DEUX EXEMPLE QUI MONTRE QUE LE PH JOUE UN ROLe important
-Cys 25 normal : 8,3 ; Cys dans le site actif : 4,2
-His 159 normal : 6,0 ; His dans le site actif : 8,2
86
a quoi sert la cavité oxyanionique
Lorsqu’une enzyme coupe une liaison peptidique, un intermédiaire chargé négativement (oxyanion) se forme pendant la réaction.
Ce type d’intermédiaire est instable.
➡️ La cavité oxyanionique sert à stabiliser cette charge négative.
87
que font les mutations Gln19Ala et Gln19Ser
ca entraine une diminution du Kcat/KM
88
a quoi consiste l’ingénierie de l’activité nitrile hydrase à partir de la papaïne.
L’ingénierie de l’activité nitrile hydratase à partir de la papaïne consiste à modifier le site actif par mutagenèse pour transformer cette protéase en enzyme capable d’hydrater des nitriles en amides.
88
que fait Gln19 dans La cavité oxyanionique de la papaïne
stabilise l’oxyanion de l’état de transition grâce à des liaisons hydrogène, notamment avec Ala et Ser, ce qui facilite la coupure de la liaison peptidique.
89
c'est quoi le thioimidate
intermédiaire formé quand un nitrile réagit avec un thiol (ex : la cystéine de la papaïne).
90
en quoi position la papaïNE HYDROLYSE ?
P2
91
quels sont les residus de la papaïne ?
Gly
Ala
Leu
Phe
Trp
92
Spécificité des protéases à cystéines: La cathepsine B
Bien qu’elle hydrolyse de préférence un substrat avec une Phe en P2, elle peut aussi hydrolyser de façon efficace un substrat possédant une arginine en P2.
93
que possede la cathepsine b
La cathepsine B possède une activité carboxypeptidase dipeptidique
93
que se passe t-il si on modifie quelques acides aminés du site actif
on peut :
changer la forme de la poche enzymatique
modifier la spécificité du substrat
➡️ donc reprogrammer l’activité de l’enzyme.
94
Deux sous-sites sont importants pour l’activité protéase de la cathepsine B:
Sous-site S2: responsable pour la spécificité pour une Phe en P2 (normalement suffisant pour activité endopeptidase)
Sous-site S2’: responsable de la spécificité positionnelle (explique l’activité exopeptidase)
95
Site actif de la carboxypeptidase A
L’atome de zinc au site actif est complexé à deux histidines, à un acide glutamique ainsi qu’à une molécule d’eau.
Un autre acide glutamique intervient dans la réaction qui n’est pas complexé au zinc.
96
La carboxypeptidase A est une...
exopeptidase
97
a quoi sert une nuclease ?
Elle coupe les liens phosphodiesters des acides nucleiques ( ADN , ARN)
98
c'est quoi un ribozyme
enzymes constituées d’ARN
99
c'est quoi un DNAzyme ?
enzymes constituées d’ADN
100
Quelles sont les mutations qu'on voit le plus souvent sur les nucleases ?
-Dicer 1
-Dnase 1
-RNaseH2
101
parle moi de Dicer1
muation codant pour la ribonuclease dacer. Elle a une role de regulation et quand elle ne fonctionne pas elle perds le controle de la proliferation ce qui engendre un risque de metasases et donc tumeur.
Rein, poumons, ovaires, thyroide
102
parle moi de Dnase1
mutation du Dnase1 et Dnase1L3. Ces nucleases nettoient mais quand elle ne marche pas il ya un dereglement de fragmentaion de l'ADN durant l'apoptose ce qui fait que l'ADN est mal coupé. La cellul verra donc ces bouts dADN mal coupé comme un corps etranger et donc reaction auto-immune ( lupus)
103
parle moi de RNaseH2
syndrome d'aicardi goutiere. Les mutations touchent l'exonuclease Trex1 et le complexe Rnase H2. Ces nucleases servent au cataboliqme des acides nucleiques mais quand ca marche pas il ya une accumulation de dechets dans la cellule ce qui cause de gros dommages neurologiques chez les enfants
104
quelles sont les applications des nucleases ?
A) Construction et identification de gènes
B) Les nucléases peuvent permettre de contrôler l’expression des gènes ou d’éditer des gènes (e.g. CRISPR/Cas9)
C) Les nucléases sont des cibles moléculaires potentielles pour le diagnostic et le traitement de cancers
D) Les nucléases peuvent être développer comme outils analytiques.
105
difference entre Ribonucléases Désoxyribonucléases
Ribonucléase (RNase) : ARN
Désoxyribonucléase (DNase) : ADN
106
Mecanisme Ribonuclease A
o La première étape est une transestérification (transfert de phosphate): la conversion du lien 3',5'- phosphodiester en lien 2',3'-phosphodiester avec coupure de la chaîne.
o La deuxième étape est l’hydrolyse du 2'-3' phosphodiester (phosphate cyclique) pour former un groupe 3'-monophosphate.
107
c'est quoi la Ribonuclease A
La ribonucléase A est une endoribonucléase qui dégrade spécifiquement les ARN simple brins avec un résidu C ou U en 5' du lien clivé.
107
comment on a fait pour stopper et analyser l'etat de transition de la ribonuclease A
grace a l'UVC (Uridine vanadate)
108
comment marche UVC
grace au grp Phe120 et a la Lys41 ( ne pas oublier aussi les His 12 et 119)
109
de quoi est constitué la Ribonuclease A
-His12 (agit comme une base)
-His119(agit comme un acide)
110
que fait la Lys41 dans la Rnase A
La lys41 stabilise l’état de transition chargé négativement par interaction électrostatique et par un pont H fort.
111
combien il ya de mecanisme pour la phosphatase alcaline ?
-2 cations
-3cations
112
Mécanisme à Trois Cations de la Phosphatase Alcaline
L’ion magnésium stabilise tantôt un groupe OH- tantôt une molécule d’eau qui sont impliqués dans l’équilibre d’ionisation de la sérine 102 et lui permet d’être un meilleur nucléophile.
Cet ion hydroxyde joue le rôle de base générale.
Un autre ion hydroxyde joue le rôle de nucléophile à l’étape #2.
113
La réaction d’auto-épissage du ribozyme des introns du groupe I se fait en 3 étapes:
1) Le groupe 3’-OH de la guanosine attaque le phosphate en 5' de l’intron pour former une liaison phosphodiester et libérer l’exon en 5’
2) Le nouveau groupe 3’-OH de l’exon en 5' attaque le phosphate en 3' de l’intron, provoquant l’épissage des deux exons et la libération de l’intron.
3) Le groupe 3'-OH de l’intron ce cyclise par une réaction de transestérification similaire à celles des étapes précédentes.
114
La ribonucléase A agit principalement sur
L'ARN simple brin
115
La première étape du mécanisme de la RNase A est :
La transesterification
116
La RNase A utilise quel type de catalyse ?
catalyse acide-base générale
117
L’auto-épissage des introns du groupe I nécessite :
Une guanosine ; La réaction est initiée par l’attaque du 3'-OH de la guanosine.
118
Les cations divalents dans les nucléases servent à :
stabiliser les charges négatives
119
Pourquoi les enzymes protéiques sont généralement plus rapides que les ribozymes ?
elles possèdent plus de groupes chimiques catalytiques
120
Les ribozymes sont-ils de “vraies enzymes” ?
Oui, car ils :
catalysent une réaction
peuvent agir en trans
ne sont pas consommés dans la réaction
121
Quelle réaction est étudiée dans le ribozyme hairpin ?
La coupure d’une liaison phosphodiester dans l’ARN.
122
Que fait un acide dans une catalyse acide-base ?
Il donne un proton (H⁺).
123
Quels résidus participent à la catalyse dans RNase A ?
His119 → acide
His12 → base
124
Quels sont les pKa des résidus de RNase A ?
His119 : pKa ≈ 6.2
His12 : pKa ≈ 5.8
125
Pourquoi RNase A est-elle très efficace ?
Parce que les pKa sont proches du pH physiologique, donc une grande fraction de l’enzyme est active.
126
Quels nucléotides jouent le rôle catalytique dans le Hairpin ribozyme ?
A38 → acide
G8 → base
127
Quels sont les pKa des résidus du ribozyme hairpin ?
A38 : pKa ≈ 5.0
G8 : pKa ≈ 9.0
128
Pourquoi les ribozymes sont-ils plus lents que les enzymes protéiques ?
R : Parce que la fraction active de la molécule est très faible.
129
Quelle est la fraction active approximative du ribozyme hairpin ?
Environ 0.01 %.
130
Combien d’états de protonation sont possibles pour la Rnase A ?
R : 4 états possibles selon la protonation de l’acide et de la base.
131
Quelle forme de la Rnase A est active ?
Acide protoné (A–H)
Base déprotonée (B⁻).
132
Quel effet a le pH sur l’activité enzymatique ?
Il modifie la protonation des résidus, donc la fraction active de l’enzyme.
133
Quel effet a un pKa éloigné de la neutralité ?
il augmente la force acide ou basique et peut augmenter la vitesse intrinsèque (k₁).
134
Quel nucléotide remplace la guanine dans le mutant ?
Diaminopurine.
134
Pourquoi un ribozyme hairpin mutant est-il étudié ?
Pour modifier le pKa de la base catalytique et observer l’effet sur l’activité.
135
Quel est le pKa de la diaminopurine ?
pKa ≈ 7.0.
136
Qu’est-ce que l’ambiguïté cinétique ?
Situation où les courbes pH-activité ne permettent pas de déterminer quel résidu agit comme acide ou base.
137
Comment résoudre l’ambiguïté cinétique ?
Avec des données structurales, par exemple la structure cristalline.
138
Quel résidu agit comme acide dans le ribozyme hairpin ?
A38.
139
Deux grandes catégories d’enzyme au niveau de la programmabilité fonctionnelle :
o enzymes programmables
o enzymes non programmables
140
c'est quoi des enzymes programmables ?
ARN interchangeable, on peut donc rediriger l'enzyme vers une autre cible tres rapidement.
exemple : crispr/cas9 ; Argonaute
141
c'est quoi des enzymes non-programmables ?
ARN intégré au complexe, Non interchangeable, Spécificité imposée, non redirigeable rapidement. La machien est donc faite pour une seule tache
ex: telomerase ( a l'extremite des chromosomes) ; spliceosome
142
comment marche argonaute ?
elle s'associe a un petit brin d'ARN guide pour faire le complexe RISC ce qui va permettre d'eteindre certains messages genetiques avant qu'ils ne deviennent des proteines
143
quelles sont les deux methodes pour faire le complexe risc avec l'argonaute
-miRNA
-siRNA
144
c'est quoi miRNA
c'est un d'ARN codé de notre ADN qui peut reguler des centaines de genes a la fois
145
c'est quoi siRNA
bout d'ARN qui vient de l'exterieur exemple d'un virus, il agit comme un systeme de securite, il a un double brin de 21 à 23 nt avec un surplomb de 2 nt sur 3'
146
parle moi de la biogenese des miRNA
elle se fait en 6 etapes :
1- Transcription du miRNA primaire (pri-miRNA)
2- Clivage par l’endoribonuclease Drosha
3- Export nucléaire par XPO5
4- Clivage par l’endoribonuclease Dicer
5- Chargement d’un miARN dans le RISC (RISC = RNA- induced silencing complex)
6 – bloquage du gène
147
parle moi de la conservation du miRNA au fil des années
les etudes ont montré que le miRNA etait le meme depuis des années et etait le meme chez presque toutes les especes sauf chez les plantes
148
comment est l'ARN dans argonaute ?
il est en un seul brin
149
est ce que la longueur d'un ARN est problematique ?
oui, car si il est trop long il va resté coller a l'enzyme et celle ci se retrouvera condamnée a lui.
150
Koff ?
taux de dissociation
151
si l'ARN est trop long comment est le Koff et le Kcat ?
le Koff : est mort
le Kcat : est en chute libre
152
quelle est la bonne taille que l'ARN doit avoir
entre 15 et 22 nt
153
quelle est la specificité de l'argonaute 2
c'est le seul argonaute qui peut directement cliver sa cible
154
parle des extremités de AGo2
5' : MID
3' : PAZ
milieu : PIWI
155
quels sont les aa qui sont dans la tetrade catalytique DEDH
-Asp597
-Glu637
-Asp669
-His807
156
quelle est la tetrade catalytique que Ecoli utilise
DEDD
157
parle moi de la reaction du slicing Ago2
la reaction depend de 2 ions Mg2+ et ce clivage crée un fragment 5′ se terminant par un 3′-OH et un fragment 3′ portant un 5′-phosphate
La RNase H clive l’ARN d’un hybride ARN-ADN grâce à un mécanisme à deux ions Mg²⁺.
1️⃣ Positionnement : le guide et l’ARNm sont alignés dans le site actif, plaçant la liaison phosphodiester cible près des ions métalliques.
2️⃣ Coordination : 3 Asp et 1 Glu coordonnent deux ions Mg²⁺, qui stabilisent les charges négatives et polarisent la liaison à couper.
3️⃣ Activation du nucléophile : un Mg²⁺ active une molécule d’eau pour former OH⁻.
4️⃣ Clivage : l’OH⁻ attaque le phosphore de la liaison phosphodiester → hydrolyse et coupure de l’ARN.
158
Que signifie “externalisation de la spécificité” ?
La spécificité de l’enzyme est portée par l’ARN, tandis que la protéine agit comme plateforme catalytique.
159
De quoi dépend la reconnaissance par un ARN guide ?
longueur de la séquence
contenu en GC
structure secondaire
contexte protéique.
160
Quels paramètres doivent être équilibrés dans la reconnaissance par ARN ?
affinité
spécificité
dynamique enzymatique (turnover).
161
Combien de protéines Argonaute existe-t-il chez l’humain ?
4 (AGO1-AGO4) mais AGO2 est la seule avec activité endonucléase.
161
Quelle région du miRNA est essentielle pour la reconnaissance ?
La région seed (nucléotides 2-7).
162
Où se trouve généralement la cible du miRNA dans l’ARNm ?
Dans la région 3’ UTR.
163
Quelle est la sequence catalytique qui permet a Ago2 de faire sa reaction enzymatique ?
DEDH, similaire à celui de RNase H.
164
Où se produit le clivage de l’ARN cible par Ago2 ?
Entre les nucléotides g10 et g11 du guide.
165
Quel est le rôle de Cas9 ?
Endonucléase qui clive l’ADN cible guidée par un ARN.
166
Quels ARN composent le guide naturel du système CRISPR ?
crRNA
tracrRNA
167
Qu’est-ce qu’un sgRNA ?
ARN guide chimérique fusionnant crRNA et tracrRNA utilisé en biotechnologie.
168
Qu’est-ce qu’un PAM ?
Motif adjacent au protospacer indispensable pour la reconnaissance de l’ADN par Cas9.
169
Quels domaines nucléases coupent l’ADN dans Cas9 ?
HNH → brin cible
RuvC → brin non cible
170
Quelles sont les deux composantes principales de la télomérase ?
TERT → sous-unité protéique catalytique
TERC → ARN matrice.
171
Quel type d’enzyme est TERT ?
Une reverse transcriptase spécialisée.
172
Quelle séquence télomérique est ajoutée chez l’humain ?
TTAGGG.
173
Quel est le rôle principal de l’ARN TERC ?
matrice pour la synthèse d’ADN
échafaudage structural
stabilisation de l’enzyme.
174
Pourquoi la télomérase est-elle non programmable ?
Parce que l’ARN TERC est une composante fixe de l’enzyme et n’est pas interchangeable.
175
Pourquoi les miRNA peuvent cibler plusieurs gènes ?
Parce que seule la région seed (~7-8 nt) est essentielle pour la reconnaissance.
176
Pourquoi les siRNA sont plus spécifiques que les miRNA ?
Ils utilisent une complémentarité presque parfaite sur toute la séquence (~22 nt).
Automne 25
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