Quelles sont les utilités du séquençage (5)?
- structure des génoms et phylogénie
- détermination de la structure d’un gène et sa fonction
- déterminer les polymorphismes (SNP)
- prédire les produits possibles de fragments ADN
- Analyser les variation génétiques
Quelles sont les deux méthodes de séquençages des années 70s?
- Chimique (maxam-gilbert)
2. Enzymatique (sanger)
Quel est le principe général de la méthode chimique (3 étapes)
- Digestion enzymatique
- Déphosphorylation 5’ (phosphatase)
- Kinaser à l’extremité 5’ avec un g-32ATP
Méthode chimique
Après un marquage, que fait-on et pourquoi?
Recouper avec une 2e enzyme de restriction pour n’avoir qu’un brin marqué au g-32ATP
Quelles sont les étapes de la méthode chimique?
à revoir
- Marquage au g-32ATP
- Digestion
- Purifier sur un gel
- Hydrolyse chimique spécifiques des 4 nucléos
- Gel dénaturant + polyarylamide
Comment et par quoi les purines sont modifiées?
Méthylation par DMS
Par quoi sont modifiée les pyrimidines?
Hydrazine
Que fait la pipéridine
- Clive les brins apyrimidiques et apuriniques
- Génère des fragments de taille correspondant à la taille des nuclos modifiés
Comment faire des modifications chimiques de A et G?
pH, sels
Que reste t il à faire après les modifications chimiques des bases?
Électrophorèse et autoradiographie
La méthode chimique:
A) peut se faire directement sur un plasmide?
B) production d’adn double brin nécessaire?
C) nécessaire de le faire migrer sur plusieurs gels?
D) permet de visualiser des nucléotides très près du site de marquage?
E) Un gel à 20% et un à 12.5%?
A) peut se faire directement sur un plasmide? Oui
B) production d’adn double brin nécessaire? Non, simple brin
C) nécessaire de le faire migrer sur plusieurs gels? Oui
D) permet de visualiser des nucléotides très près du site de marquage? Oui
E) Un gel à 20% et un à 12.5%? Non un à 20 et un à 8%
Quels sont les désavantages (3) de la méthode chimique?
- très capricieux
- extrême sensibilité à la fraîcheure
- pureté des réactifs
Sur quoi repose la méthode enzymatique?
A) une phosphorylation de la base 5’
B) une interruption de l’adn pol en phase d’initiation
C) une interruption de l’adn pol en phase d’élongation
C) une interruption de l’adn pol en phase d’élongation
Méthode enzymatique:
Que faut il, avec l’adn pol?
di-déoxynucléotide (2’3’-didéoxynucléo tri phosphate)
Méthode enzymatique:
Que faut il dans une “chain terminator”
- ddNTPs
- Pas de OH sur le 3’C du déoxyribose
Méthode enzymatique:
Quelles molécules a t on utilisé pour marquer l’adn et pourquoi a t on changé?
- a-P32-ATP
- a P33 ATP: plus longue 1/2 vie
- a 35S ATP: meilleure résolution , signal moins puissant
Quel était le problème de la méthode enzymatique
A) la résolution des gels
B) l’extension d’amorce
C) le marqueur d’adn
A) la résol!
A) À quoi sont couplés les ddNTPs
B) À quoi servent ils?
A) Des fluorochromes de couleurs différentes
B) Électrophorèse capillaire en continu, réaction dans un seul tube
À quoi sert une extension d’amorce (2)?
localiser le site d’initiation de la transcription d’un gène
et
permet de délimiter la région promoteur (caractériser les régions régulatrices)
Que permet la caractérisation d’un promoteur (3) ?
- expression d’un gène régulé selon le tissus, l’âge
- connaître les composantes: pathologies dues à l’expression ectopique d’un gène
- focer l’expression d’un tissus spécifique d’un transgène
Comment peut aussi se faire la régulation de l’expression génique?
au niveau de la région 5’ non codante d’un mRNA
Comment localiser le site d’initiation de la transcription d’un gène?
- réaction d’extension d’amorce marquée radioactivement (complmentaire au gène et région d’homologie près de ATG)
- réaction d’élongation avec un RT
Comment la RT va agir?
Elle va allonger / copier en adn, l’arnm du gène jusqu’à ce qu’elle atteigne l’etrémité 5’ du messager et la fin de l’élongation correspond au site d’initiation de la transcription
Comment séquencer un arnm par primer extension?
- Preparer un hybridation de l’amorce marquée radioactivement
- Séparer en 4 tubes
- Faire une extension à la RT en modifiant dNTP/ddNTP
(RT moins sensible à la présence de ddNTP pour inhiber l’extension ou bloquer l’élongation)
