Vrai ou faux. On évalue l’expression d’un gène en
mesurant directement le niveau
d’ARN seulement.
Faux. des protéines aussi (protéomique)
Quelles sont les étapes de la quantifiation de l’expression
1) Expression du gène X -> Amplification par PCR
OU
2) Identification de gènes exprimés simultanément (avec région du promoteur) -> Extraction d’ADN génomique
PUIS
- Digestion avec enzymes de restriction
-Clonage dans un vecteur d’expression qui contient le gène rapporteur
- Transformation (plasmidique ou chromosomique)
- Croissance dans différentes conditions
- Quantification de l’expression
Quelles sont ls étapes de la mesure de la B-galactosidase?
- Ajuster la densité optique à 0.6 (DO 600 )
- Lyse de la culture bactérienne (v) (Z-buffer + chloroforme+ SDS)
- Ajout du substrat (ONPG)
- Incubation à 28 C
- Partir la minuterie (t)
- Arrêt de la réaction (Na2CO3) lorsque devient jaune
- Prendre la DO 550 et DO 420
- Calculer les unités de B-galactosidase
Comment calculer les unités miller
1000 x (DO 420 – 1.75 x DO 550 ) / (t x v x DO 600)
Par quoi est produit la luciférase et comment réagit elle?
Lux(bact) et luc (mouche)
Luciférase + luciférine = Photon
Vrai ou Faux. L’incorporation de la luciérase n’incorpore AUCUNE perturbation dans la cellule?
Vrai
À quoi sert la GFP dans
A) Fusion de promoteur
B) l’ettiquette
A) Fusion de promoteur: pour mesurer l’expression génique
B) Etiquette (protéine hybride): Localisation cellulaire
GFP, est elle:
A) stable ou instable
B) toxique ou non-toxique
Protéine stable, non-toxique
À quoi peut servir le gène rapporteur? (3)
Déterminer le niveau d’expression
Déterminer la condition favorisant l’expression maximale
Déterminer la localisation
Quelle sont les méthode d’analyse de l’expression génique de l’ARN?
- Northern Blot (10 ug)
- RT
- RT-PCR
- qRT-PCR (ng)
- Biopuce « microarray » (ug)
- RNA-Seq (1 fg)
Quand utilise t on: RT, RT-PCR, qRT-PCR (6)
- Quantité et qualité de l’ARN : reproductibilité et relevance biologique
- Sans ADN ( DNA-free )
- Pas d’inhibiteur co-purifié de la RT; Sans nucléase
- Besoin de la séquence
- Quelques gènes testés en simultanés
- Normalisation problématique
Aplication de la RT? (4)
Biologie moléculaire
Expression des gènes
Quantification
Diagnostic
Que quoi consiste le transcriptome?
- Ensemble des ARN (ARNm, ARNt, ARNr, etc)
* Identification des gènes exprimés
À quoi sert le transcriptome (3)?
– Caractériser la transcription
– Comparer la transcription
– Quantifier la transcription
Quelles sont les 2 méthodes d’étude transcriptomique?
Micropuces
RNA-Seq
Quels sont les avantages (1), les désavantages (3) des biopuces?
• Avantage
– Mesure simultanément l’expression de tous les gènes d’un organisme
• Désavantages
– Dégradation de l’ARN: courte 1/2 vie
– Marquage (plusieurs microgrammes de matériel)
– Interprétation
Quels sont les types de biopuces?
– ORF (produit PCR - Hybridation)
– Oligonucléotide (amorce)
Quelles sont les 3 manières de faire des biopuces (3 processus)
A) Genomic comparison: transcrire l’ADN, étiquetter, hybrider
B) Expression analysis: transcrire en ARN, RT, étiquetter, hybrider
C) Transposon site hybridization: Transcrire de la jonction, étiquetter, hybrider
Associer:
A) Bioinformatique
B) Expression d’un gène bactérien durant l’infection
C) Expression de tous les gènes bactériens durant l’infection
1) fonction possible d’un gène (1/3 inconnu)
2) transcriptome
3) Rien sur son expression (ARN)
4) qRT-PCR
A) Bioinformatique
1) fonction possible d’un gène (1/3 inconnu)
3) Rien sur son expression (ARN)
B) Expression d’un gène bactérien durant l’infection
4) qRT-PCR
C) Expression de tous les gènes bactériens durant l’infection
2) transcriptome
Comment peut on protéger de l’infection de macrophage
Gentamycine
Quelles sont les applications de SCOTS (5)?
- Donne un aperçu de l’interaction hôte-pathogène
- Identification de gènes appropriés
- Méthode applicable à tout microorganisme
- Aucune nécessité de technique génétique spécialisée, libraries…
- Détecte l’expression de gènes à partir de peu de bactéries
Quels sont les avantages de Rna-seq? (4)
- Séquençage d’ARN à haut débit
- Détecter la présence et la quantité de tous les ARN
- Caractérise les différentes populations d’ARN: sRNA, ARN antisens régulation
- Pas besoin de connaître le génome (microarray)
Quelles sont ls 2 application de Rna-seq?
SNP (polymorphisme nucléotidique):
Découverte de mutation impliquée dans le cancer
*Gène différentiellement exprimé
