Jak definiuje się mikrobiologię przemysłową?
Mikrobiologia przemysłowa to dział mikrobiologii dotyczący możliwości wykorzystania drobnoustrojów do procesów przemysłowych, m.in. w przemyśle chemicznym, farmaceutycznym, browarniczym, piekarskim, winiarskim, kosmetycznym. Zajmuje się wykrywaniem, badaniem i dostosowaniem do przyszłego wykorzystania metabolicznych procesów i właściwości drobnoustrojów.
Podaj zastosowania mikrobiologii przemysłowej w przemyśle farmaceutycznym.
• Wyselekcjonowane szczepy do produkcji antybiotyków, witamin i leków steroidowych • Wyselekcjonowane kultury bakterii i drożdży do produkcji probiotyków • Hodowla komórek i tkanek do produkcji szczepionek i przeciwciał monoklonalnych • Rekombinantowe szczepy stosowane do produkcji szczepionek, insuliny czy hormonu wzrostu
Podaj etapy projektowania procesu biotechnologicznego.
1) Pomysł – co chcemy i jesteśmy w stanie produkować 2) Analiza marketingowa – ocena opłacalności produktu 3) Poszukiwania organizmu producenckiego 4) Opracowanie biotechnologii 5) Analiza ekonomiczna produkcji 6) Ochrona patentowa oraz wdrożenie produkcyjne
W jaki sposób poszukiwane są organizmy producenckie?
• Na drodze Screeningu – poprzez izolację szczepów z miejsc ich bytowania, w zależności od poszukiwanej przez nas cechy • Przeszukiwanie dostępnych kolekcji mikroorganizmów pod kątem pożądanej cechy • Wykorzystanie organizmów pozyskanych ze screeningu lub z dostępnym kolekcji jako źródeł genów do skonstruowania rekombinowanego szczepu mikroorganizmu. Tej metody używamy gdy na pozostałych dwóch drogach nie jesteśmy w stanie znaleźć organizmu, który spełnia wymagania idealnego mikroorganizmu producenckiego
Jakie wymagania powinien spełniać idealny organizm producencki?
• Musi produkować interesujący nas produkt tak szybko jak to możliwe, jak najprościej i jak najtaniej • Musi być łatwo dostępny w postaci czystej kultury, a co za tym idzie być łatwy w przechowywaniu przez długi okres czasu • Musi być genetycznie stabilny i jednocześnie łatwo ulegający manipulacjom genetycznym • Musi być łatwy w hodowli na dużą skalę na dostępnych podłożach przemysłowych • Nie może być organizmem patogennym
Jakie warunki powinny być zapewnione podczas pobierania i transportu prób mikrobiologicznych?
Podczas pobierania próbek ważne jest spełnienie zasady aseptyki, tzn nie wprowadzenie do próbki innych organizmów niż te, które występują w danej niszy. Ważne jest też zachowanie warunków istniejących w środowisku, skąd pobrano drobnoustroje, a więc zachowanie odpowiedniego natlenienia, pH, temperatury, wilgotności i naświetlenia. Do pobrania prób u transportu należy używać odpowiednich do tego przyrządów – specjalistycznych pojemników wysterylizowanych promieniowaniem jonizującym. Należy też maksymalnie skrócić czas całej procedury i pobrany materiał umieścić w probówce do 5 minut od pobrania, a drobnoustroje najlepiej oznaczyć do 6h od pobrania.
Na czym polega skrining losowy?
Skrining losowy to badanie wyizolowanej populacji w warunkach typowych dla jej wzrostu i biosyntezy określonego metabolitu przez: • Rozsiew populacji komórek na podłoże stałe w celu izolacji monokultur • Przeprowadzenie testów fermentacyjnych określających aktywność wybranych losowo kolonii pod względem poszukiwanej cechy. Skrining losowy może być usprawniony przez stosowanie specjalistycznych substratów lub wskaźników w podłożu testowym.
Na czym polega bezpośredni racjonalny skrining?
Przy skriningu racjonalnym podobna procedura jak przy skriningu losowym, ale dodatkowo wprowadzane są warunki, które pozwalają na ograniczenie wzrostu niepożądanych kultur lub hamują ujawnianie się niekorzystnych cech i tym samym ułatwiają selekcję najcenniejszych monokultur. Przy skriningu racjonalnym bezpośrednim prowadzi się hodowlę w warunkach chemostatu przy stężeniu substratów ograniczającym wydzielanie produktu lub z dodatkiem substancji determinującej proces biosyntezy.
Co to są auksotrofy?
AUKSOTROFY – mutanty z deficytem enzymu uczestniczącego w biosyntezie czynnika wzrostowego (aminokwasu, witaminy, zasady purynowej lub pirydynowej). Dla wzrostu tych mutantów konieczne jest dodanie do pożywki brakującego składnika, np. brakującego aminokwasu. Auksotrofy mogą wytwarzać metabolity pośrednie, które mogą pełnić rolę prekursorów dla innych syntez. Izolacja auksotrofów może być metodą skriningu drobnoustrojów właśnie pod kątem takich metabolitów.
Omów metodę izolacji auksotrofów przy pomocy stempla.
Polega na posiewie mutantów na pożywkę kompleksową. Po okresie inkubacji kolonie odciska się stemplem i daje na pożywkę minimalną mającą deficyt danego składnika. Dostaniemy wtedy obraz, które kolonie to auksotrofy (te, które nie wyrosły na podłożu selekcyjnym) i to je izolujemy.
Zdefiniuj i omów selekcję mutantów konstytutywnych.
MUTANTY KONSTYTUTYWNE – szczepy, u których mutacja wywołała ekspresję genów kodujących enzymy niezależną od induktora lub represora. Metody selekcji: a) Hodowla ciągła w stanie chemostatu, w której dodano induktor syntezy enzymu w stężeniu poniżej stężenia wymaganego dla indukcji biosyntezy. b) Stosowanie substratu, który jest słabszym induktorem produkcji określonego białka. c) Selekcja mutantów w pożywce, do której dodano zarówno induktor, jak i represor. d) Wykorzystanie reakcji barwnych dla identyfikacji konstytutywnych mutantów spośród kolonii wyrosłych na podłożach z substratem pokrewnym, niebędącym induktorem syntezy enzymu.
Wymień metody pośrednie racjonalnego skriningu i opisz wybraną.
• Detekcja i rewersja auksotrofów • Selekcja mutantów konstytutywnych • Selekcja mutantów w kierunku obniżenia stopnia inhibicji produktem końcowym • Selekcja mutantów opornych w stosunku do toksycznych analogów metabolitów pośrednich • Selekcja mutantów o korzystnej morfologii lub o właściwościach detoksykacyjnych • Selekcja w kierunku zwiększenia przepuszczalności ściany komórkowej lub obniżenia wrażliwości szczepów w stosunku do wybranych składników pożywek lub prekursorów Selekcja mutantów o właściwościach detoksykujących: do pożywki dodaje się toksynę w małym stężeniu hamującym wzrost. Stężenie toksyn podnosi się w kolejnych pasażach. Używane toksyny to metale ciężkie, antybiotyki i ksenobiotyki.
Jakie cechy mikroorganizmów można zmodyfikować poprzez odpowiednio dobraną metodę selekcji?
• Właściwości detoksykujące • Obniżenie wrażliwości • Zdolność do peletyzacji u grzybów strzępkowych • Zdolność do flokulacji drożdży browarniczych • Zwarta struktura grzybni • Przepuszczalność błony komórkowej • Odporność na toksyny
Wymień typy mutacji.
1) Spontaniczne – zachodzą samoczynnie 2) Prowokowane przez czynniki mutagenne ⎯ Punktowe ⎯ Indele ⎯ Zmieniające ORF 3) Transpozonowe in vivo (elementy Tn) 4) Kierunkowe in vitro – inżynieria genetyczna
Objaśnij mutację zmiany sensu.
Typ punktowej mutacji genowej wywołanej przez substytucję pojedynczego nukleotydu na DNA lub RNA. Prowadzi ona do zmiany aminokwasu w powstającym białku. W zależności od efektu możemy ją podzielić na dwa rodzaje: • Konserwatywna – zmiana aminokwasu na inny nie powoduje dysfunkcji syntetyzowanego białka • Niekonserwatywna – zmiana aminokwasu na inny powoduje zmianę funkcji białka co może skutkować dużymi zmianami w fenotypie organizmu.
Na czym polega mutacja zmieniająca ramkę odczytu?
Poprzez insercję lub delecję pojedynczego nukleotydu przesuwa się cała ramka odczytu, co wiąże się ze zmianą całej sekwencji białka poniżej mutacji, zatem może znacząco wpływać na fenotyp.
Scharakteryzuj proces mutagenizacji z udziałem promieniownia UV.
Mutageneza UV zachodzi przy długości fali 254-265 nm i cechuje się wysoką częstotliwością powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego. Dodatkowo cechuje ją też: • dostępność i łatwość użycia źródła promieniowania • Łatwość dozowania dawek (dostosowania mocy lampy, czasu i odległości od komórek) • Łatwość odtwarzania warunków mutagenezy • Możliwość wywołania mutacji w rosnących komórkach wegetatywnych i sporach.
Wyjaśnij pojęcie tasowanie genomowe.
Tasowanie genomowe (genome shuffling) – polega na wymieszaniu in vitro genomów dwóch odmiennych fenotypowo mutantów – klonów na drodze przypadkowej fragmentacji i łączenia DNA w nowe pule genomowe. Dochodzi do przemieszania fragmentów DNA i uzyskania nowych komórek zawierających przypadkową mieszaninę fragmentów DNA szczepów wyjściowych. Daje to szansę na uzyskanie mutanta, który zgromadzi wszystkie, z punktu technologicznego, komponenty genów.
Wymień przykłady kryteriów skriningu.
• Produktywność (maksymalne stężenie, wydajność) • Odporność na wysokie stężenie substratu i produktu • Szybkość wzrostu • Tolerancja na niskie pH • Termotolerancja • Odporność na ciśnienie osmotyczne • Odporność na antybiotyki • Odporność na fagi • Odporność na rozpuszczalniki
Jak eliminuje się szczepy kwasotwórcze?
W trakcie metabolizmu cukrów i innych źródeł węgla, np. glicerolu produkowane są kwasy organiczne. Do kultur dodaje się mieszaninę bromku sodowego (NaBr) i bromianu sodowego (NaBrO3). W trakcie produkcji kwasów i ich dysocjacji wewnątrz komórki uwalniają się jony protonowe, które reagują z mieszaniną bromianową. Uwolnione są wolne atomy bromu – toksyczne dla komórek. W ten sposób komórki wytwarzające kwas giną, a w pożywce są już tylko te mutanty, które mają deficyt kwasowy. Metoda nie wymaga stosowania specjalnych pożywek. Wystarczy taka z cukrem lub innym źródłem węgla fermentowanym do kwasu karboksylowego.
Co to jest protoplastyzacja i czego wymaga do przebiegu?
Protoplastyzacja polega na enzymatycznym rozpuszczeniu ścian komórkowych danego mikroorganizmu. W przypadku bakterii, ściana komórkowa składa się głównie z peptydoglikanu i używa się lizozymu, endolizyny czy mutanolizyny. W przypadku grzybów, w skład ściany komórkowej wchodzą polisacharydy, stąd najczęściej stosuje się celulazy, β-glukanazy, chitynazy.
Dlaczego elektrofuzja nie może być stosowania do wszystkich mikroorganizmów? Podaj przykład.
Jakie są najczęstsze cele inżynierii genetycznej?
• Zwiększenie bazy substratowej • Synteza określonych białek biologicznych czynnych (enzymów, interferonów, inter
w skład ściany komórkowej wchodzą polisacharydy, stąd najczęściej stosuje się celulazy, β-glukanazy, chitynazy.
