דגימות עבות במיוחד
ככל שהדגימה עבה יותר, כך קשה לאורכי גל קצרים לחדור דרכה ולהגיע למטרה.
two photon microscopy
שיטה בה משתמשים בשני פוטונים בעלי אורכי גל ארוכים (מקל עליהם לחדור את הרקמה). הפוטונים פוגעים זה אחר זה (בפער קצר מאוד) בדגימה, כך שהתוצאה שוות ערך לפגיעה באורך גל קצר יותר. בשיטה זו ניתן לעורר סמנים בעומק של 250 מיקרומטר. מאפשרת ניתוח פעילות בקורטקס של חיה בעודה בחיים.