Wouter Suring Transcriptomics deel 1

Question 1

Wat betekent meer genexpressie in zijn algemeen?

Answer 1

Meer transcripten van het gen in een cel.

Question 2

Wat is het Transcriptoom?

Answer 2

Alle transcripten in een biologisch monster; cel, weefsel, lichaamsvloeistof.

Question 3

Wat is Transcriptomics?

Answer 3

Onderzoek aan de complete set aan RNA transcripten die onder specifieke omstandigheden of op een specifieke locatie (bijv. cel, weefsel, vloeistof) aanwezig zijn.

Question 4

Hoe werkt transcriptoomanalyse? Oftewel: hoe bepaal je welke genen er harder of zachter aan staan onder verschillende omstandigheden?

Answer 4

Stappen:

1. Samples nemen
2. Sample preparation
3. RNA sequencing
4. Quality control
5. Pseudoalignment
6. Normaliseren
7. Differentiële genexpressie-analyse

Question 5

1. Samples nemen

Answer 5

• Meestal verschillende condities, bijvoorbeeld controlegroep en behandelgroep.
• Replica’s, om met meer zekerheid te kunnen zeggen dat er werkelijk een verschil bestaat.
  controle 1 en controle 2, behandelgroep 1 en behandelgroep 2.

Question 6

2. Sample preparation

Answer 6

• RNA isolatie.
• Omzetting naar cDNA met reverse transcriptase.
• Library preparation

Question 7

Wat gebeurt er tijdens library preparation?

Answer 7

Zorgen dat het zuiver is en alleen DNA is,
zorgen dat de fragmentgrootte goed is,
adapters (kleine stukjes sequentie) aanplakken om te kunnen sequencen.

Question 8

Wat is een Adaptersequentie?

Answer 8

bijv. ACTG, een vaststaande sequentie. Wordt geplakt aan je cDNA, zodat die erna weer kan binden aan de bodem van het sequencing apparaat.

Question 9

3. RNA sequencing

Answer 9

• Na het sequencing krijg je per sample een tekstbestand terug.
• In dat tekstbestand staan reads, stukjes sequencing (vaak miljoenen).

Question 10

4. Quality Control

Answer 10

Is de nucleotide echt de juiste die er staat? Zekerheid wordt aangegeven door apparaat.

Question 11

Wat gebeurd er met de reads tijdens de stap Quality Control?

Answer 11

• Basen van slechte kwaliteit verwijderen

Question 12

Wat gebeurd er als je adapter ook gesequenced is?

Answer 12

Als het stukje cDNA dat je sequencet korter is dan de lengte van de read kan er een adaptersequentie in je read zitten
–> Illumina verwijdert deze sequenties en je kan er zelf ook nog op controleren.

Question 13

5. Pseudoalignment

Answer 13

Voor elk gen bepalen hoe hoog de expressie is in elk sample. Mappen van de reads tegen het humane referentiegenoom

Question 14

Hoe ontstaan reads en wat kan je er mee?

Answer 14

• Je hebt een sample met RNA moleculen.
• Die moleculen ga je sequencen en je krijgt miljoenen stukjes sequentie terug van die moleculen.
• Al die stukjes sequentie die je terug krijgt zijn reads.
  Veel reads = expressie hoog, Weinig reads = expressie laag.

Question 15

6. Normaliseren

Answer 15

Samples gelijktrekken.

Als een gen veel hoger tot expressie komt in een sample dan lijkt het alsof de andere genen laag tot expressie komen.

Question 16

7. Differentiële genexpressie-analyse

Answer 16

Bepalen welke genen hoger of lager tot expressie komen tussen groepen
Bepalen welke genen er een statistisch significant verschil laten zien tussen controlegroep en behandelgroep.

Question 17

Wat betekent de fold change?

Answer 17

Hoeveel keer hoger is de expressie van een gen in het ene sample dat het andere sample.