PCR

Question 1

Vad är PCR?

Answer 1

En metod för att exponentiellt amplifera ett specifikt DNA-segment in vitro med hjälp av cyklisk temperaturväxling, primers och ett värmestabilt DNA-polymeras.

Question 2

Vilka är de obligatoriska komponenterna i en PCR-reaktion?

Answer 2

Template-DNA

Forward primer + Reverse primer

DNA-polymeras

dNTP:er

Mg²⁺

Buffert

Vatten

Question 3

Vad händer i denatureringssteget?

Answer 3

Dubbelsträngat DNA separeras till enkelsträngar genom upphettning (~95 °C) som bryter vätebindningar mellan baserna.

Question 4

Vad händer i annealing-steget?

Answer 4

Primers binder (hybridiserar) till sina komplementära sekvenser på template-DNA vid en temperatur ca 5 °C under primerernas Tm.

Question 5

Vad händer i elongeringssteget?

Answer 5

DNA-polymeraset förlänger primers i 5’→3’-riktning genom att addera dNTP:er från primerens fria 3’-OH-ände (oftast vid 72 °C).

Question 6

Varför behövs två primers?

Answer 6

För att definiera båda ändarna av målsekvensen —-> Forward/Reverse primer och möjliggöra exponentiell amplifikation av just det DNA-segmentet.

Question 7

Vad är en forward primer?

Answer 7

En primer som binder till antisense-strängen och förlängs i riktning mot målregionen.

Question 8

I vilken riktning syntetiserar DNA-polymeras DNA?

Answer 8

Alltid 5’ → 3’, genom att addera nukleotider till en fri 3’-OH-grupp

Question 9

Vad menas med Tm (melting temperature) för en primer?

Answer 9

Temperaturen där 50 % av primer-DNA-duplexen är denaturerad

Question 10

Varför är Mg²⁺ absolut nödvändigt i PCR?

Answer 10

Mg²⁺ är kofaktor för DNA-polymerasets katalys av fosfodiesterbindningar och stabiliserar interaktionen mellan dNTP och DNA.

Question 11

Vad menas med affinitet hos DNA-polymeras?

Answer 11

Hur starkt polymeraset binder till DNA; hög affinitet → polymeraset sitter kvar längre → högre processivitet.

• Hög processivitet → polymeraset sitter kvar länge och syntetiserar långa sträckor
• Låg processivitet → polymeraset släpper ofta och måste binda in igen

Question 12

Vad menas med fidelity?

Answer 12

Hur korrekt polymeraset kopierar DNA. Hög fidelity = färre misstag

Question 13

Varför lämpar sig PCR för att analysera SBMA?

Answer 13

PCR kan exakt amplifera repeat-regionen, och fragmentlängden (antal CAG-repeats) kan sedan bestämmas med elektrofores.

Question 14

Varför är det vanligt med mycket G-C rika regioner vid primer i PCR?

Answer 14

G-C-rika regioner ökar PCR-specificiteten genom stabilare primerbindning och högre Tm, särskilt vid 3’-änden, vilket minskar ospecifik priming.

Question 15

En DNA-sekvens amplifieras enzymatiskt in vitro. Trots tillgång på fria nukleotider sker ingen syntes. Vad är den mest sannolika orsaken?

A. Polymeraset saknar ATP
B. Temperaturen är för låg
C. Det finns ingen fri 3’-OH-ände
D. Mallsträngen är enkelsträngad
E. Nukleotiderna är fel fosforylerade

Answer 15

C

Det finns ingen fri 3’-OH ände

Question 16

Beskriv egenskaperna hos ett bra/väl fungerande par PCR-primers.

Answer 16

Längd: Vanligtvis 18-24 baser lång.

GC-innehåll: Helst 40-60%, med en GC-klämma vid 3’-
änden.

Smälttemperatur (Tm): Mellan 50-60°C, med båda primers med liknande Tm-
värden.

Specificitet: Primers bör vara specifika för målsekvensen utan betydande homologi
till andra sekvenser.

Primer-dimerer: Undvik primer-dimerer.

Självkomplementaritet: Undvik.

Question 17

Beskriv egenskaperna hos ett bra/väl fungerande DNA-polymeras om jag söker mängd DNA i PCR och varför.

Answer 17

Snabb och hög mängd DNA (kvantitet prioriteras):

• Hög förlängningshastighet
• Hög processivitet
• Ingen eller låg proofreading → fler fel tolereras

Exempel → används vid screening, rutin-PCR, när sekvensen inte är kritisk

Question 18

Beskriv egenskaperna hos ett bra/väl fungerande DNA-polymeras om jag söker mer precist DNA i PCR och varför.

Answer 18

Hög precision (sekvenskvalitet prioriteras):

• Hög fidelitet
• 3’→5’ exonukleas (proofreading)
• Lägre hastighet accepteras

→ används vid kloning, sekvensering, mutationsanalys