Vorlesung 1: Nucleinsäurefragmente

Question 1

Magic Bullet

Was ist das Ziel?

Wie ist der Aufbau?

Answer 1

• geht nur an Wirkort, keine unbeabsichtigten Schäden
• Über ZIP-Code (Ligand) Spezifität und Selektivität

Nanopartikel mit PAYLOAD (siRNA),PEG-Hülle und Ligand (Zip-Code, Rezeptor Ligand WW)

Question 2

Welche Therapeutische Konzepte gibt es?

Answer 2

• Am häufigsten ist der Ansatz “Loss of function.”
  
  • reduzierte oder keine Aktivtät des Targetproteins
• Gegenteil: “Gain of function”
  
  • vorhandene Aktivität erhöhen oder neue Aktivität initiieren

Question 3

Welchen Einfluss hat die chemische Verbesserung der Basenlabiltät der Nucleinsäure?

Answer 3

• biochemische und metabolische Stabiltät
• Erkennung durch das angeborene Immunsystem
• Membrangängigkeit
• Hybridisierung an komplementären Sequenzen (antisense oder siRNA)

Question 4

Druggable Proteome

Definition?

Answer 4

• Proteinfraktion (Gruppe von Proteinen):
  
  • binden small molecules oder Antikörper
  • sind potentielle Drug Targets
  • verknüpft mit einer Erkrankung

Question 5

wie versieht man die modfizierte mRNA mit Cap-Struktur? (wenn noch nocht bei Snythese passiert)

Answer 5

1) mit viralen Enzyme wie Vacchina capping Enzyme: bildet ein Triphosphat
2. )Methylierung mit 2 O’methyltransferase

Verfolgung Reaktion über Radioaktiven Assay (H³ Assay, Nuklid sitzt an der Methylgruppe)

Question 6

Analytik

Nachweis von modifizierten NA?

Answer 6

1. Verdau von Oligonucleotiden mit Nucleasen
2. LC-MS/MS zur Quantifizierung

Question 7

Biodistribution of mRNA polyplexes

Wie untersucht man ob die entwickelten Vacchine an den Wirkort gelangen?

Answer 7

mRNA wurde mit langkettigen Kationen (mRNA polyplexes) in verschiedenen Verhältnis gemischt

negative geladene Mischungen sammeln sich in der Milz (Ort der Dendritschen Zellen>Immunantwort)

In dendritischen Zellen Translation der mRNA, Epitope werden exprimiert> Zellen Präsentation der selbstsynthetisierten Epitope den MHC-Komplexen>humorale Immunantwort (AK-Vermittelt)

Question 8

Herstellung synthetischer mRNA (zur Synthese jedes beliebigen Proteins)

Prinzip?

Answer 8

Zutaten:

• doppelsträngige DNA mit relevanter Sequenz (Gewinnung aus Plasmiden oder PCR)
• NTPs oder modifizierte NTPS (=XTPs)
• rekombinantes Enzym T7-RNA-Polymerase

POLYMERASE mit CAP-Struktur > Transkription>modifizierte RNA mit CAP-Struktur

Question 9

Konzept SNALP (Stable nucleic acid lipid particle)

Wie wird die si-RNA verpackt?

Answer 9

• Hülle: Doppellipidschicht
• auf der Oberfläche PEGylierung (Verknüpfung mit Polyethylenglycol)
  
  • dadurch Verhinderung dass Proteine daran binden bei Zirkulation im Blut
  • und Medikament wird nicht so schnell erkannt & ausgeschieden
• siRNA im Innern
• Fusogenic lipid: sorgt für Aufname Endosomen> Ansäuerung zum Lysosomen
• Freisetzung payload

Question 10

Zentrales Dogma und Intervention

Wie beeinflusst antisense NA die Proteinbiosynthese?

Answer 10

• stöchimetrische Mengen antisense NA (1 Molekül pro mRNA)
• ist komplementär zur mRNA
• Hybridisierung: blockiert einen Bereich der mRNA

>keine Translation

Question 11

Adjuvant Effekt

Was ist das?

Answer 11

Dendritische Zellen bekommen Signal das Immunantwort benötigt

Initiierung durch PAMPs(pathogen associated molecular pattern) und deren Rezeptoren PRRs-Pattern Recognition Receptors (zB Toll-like-Rezeptoren, relevant für uns TLR 7 &8)

TLRs erkennen nackte nicht modifizierte RNAs > Ausdifferenzierung in Reife der Dendritischen Zellen>reife Zellen Immunstimulation

Question 12

Konzept der Krebsvacchine

Wie werden Vacchine entwickelt?

Answer 12

• In Maus werden Tumorzellen implantiert
• Nach Wachstum der Tumore Extraktion>DNA oder RNA Sequenzierung>
• Identifizierung der Mutationen in den Tumoren
• Test welche der Isolierten Mutationen als Effektoren einer Immunantwort funktionieren
• Codierung als mRNA und Anhängen an Peptid
• Injektion in Maus, Test ob Immunantwort

Question 13

Welche Nucleinsäuren wirken als Agonisten?

Answer 13

• produzieren mehr Proteine mit mehr Funktion oder relative neuer Funktion
  
  • mRNA
  • antagomir
• Effekt des doppelt negativen: miRNA sinkt Proteinanzahl, dieser Effekte wird durch antagomir aufgehoben

Question 14

Humanes Genom

Wieviel Chromosomenpaare?

Wieiviel Nukleotide?

Wieviel Protein codierende Gene?

Answer 14

23 Chromosomenpaare

3*10⁹ Nukleotide

ca. 20 000 Protein codierende Gene (<2%!)

Question 15

siRNA (small interference RNA)

siRNA dient der Regulierung Genxpression,darum Ansatz Zuführung synthetischer siRNA

Wie entstehen natürliche siRNA?

Wirkungsweise?

Was passiert wenn RISC-Komplex mit miRNA beladen wird?

Answer 15

• lange doppelsträngige RNAs (Alarmsignale in der Zelle)>durch DICER>Zerkleinerung in siRNA(19-23bp) mit vollständiger Basenpaarung
• Bildung RISC Komplex mit siRNA oder miRNA
• Komplex mit miRNA: Suche nach Basenpaarung >findet downstream target mRNA >Stop Translation
• Komplex mit siRNA:findet komplementäre Sequenz einer Target mRNA>RNase Aktivität des RISC-Komplexes zerschneidet mRNA>mRNA Degradierung und Gene silencing

Question 16

antagomire

Wirkungsweise?

Answer 16

über antisense effect wird die miRNA aus dem RISC Komplex abgefangen da antagomire komplementär sind

die Translationsrepression würde wieder aufgehoben werden

Question 17

Wie werden small molecules drugs genannt die:

a) einen Loss of function Effekt haben?
b) einen Gain of function Effekt haben?

Answer 17

a) Inhibitoren oder Antagonisten
b) Aktivator oder Agonisten

Question 18

Wie funktioniert LC-MS/MS?

Answer 18

reversed phase HPLC zum Auftrennen der Nucleoside aus RNA

Heraussuchen der Phase die von Interesse und noch während Eluation ESI

Analyse durch Triple Quadrupol über elektrische Felder

Question 19

Exon-skipping

Was ist Exon-skipping?

Answer 19

• Beispiel:Erberkrankung spinal muscular atrophy:defektes Gen mit Stopmutationscodon (Exon 4)
• Exons werden eingspliced aber ab dieser Stelle keine Translation
• Therapeutischer Ansatz: Injektion antisense- Oligonukleotid
• “verdecken” Mutiertes Stopcodon (keine Erkennung)> kein Splicing dieses Exons
• Exon 3 und 5 hintereinander>funktionelles Protein das Pathogenese unterdrückt

Question 20

Wie kann die Basenlabiltät der Nucleinsäuren verbessert werden?

Answer 20

Einbau von

• Phosphothioate (bessere Abschirmung gegen nucleophile Angriffe)
• 2’O-methyl (zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
• 2’Fluoro(zum Entschärfen eines potentiellen Nucleophils)
• LNA (locked NA): EInbau Methylengruppe, verknüpft mit 4’Position (Stabilisierung der Basenpaarung der Nucleotide durch Beeinflüssung des Konformation des Zuckers zusätzlich Hydrolyseschutz)
• 2-Fluoro-arabino (Antieffektiva wie bei Virostatika)

Question 21

Exon-skipping

Was ist ein Exon?

Was ist Exon-skipping?

Answer 21

• Exon: der Teil des Gens der beim Splicing den Kern verlässt
• wird aus pre-RNA in die mRNA eingebaut

Question 22

Wie ist ein Tripel Quad aufgebaut?

Wie können bei der LC-MS/MS spezifisch Fragmente durchgelassen werden?

Answer 22

• nach Ionisation Nucleoside um eine Masseneinheit schwerer
• Q1:Gate=nur bestimmte Ionen werden durchgelassen, Einstellung über Polarität der 4 Dipole durch Veränderung Wechselstromfrequenz
• Q2: collision chamber=Kollision Ionen mit Gas > Fragmentierungsreaktionen (Bruch der Glykosidischen Bindung)
• Abtrennung der Ribose, Nucleobase trägt posetive Ladung
• gelangt in Q3 und in Detektor

Question 23

Wieviel Gene sind mit Krankheitsbilder verknüpft?

Wieviele könnten als Targets dienen?

Answer 23

• von bekannten 20 000 Genen stehen experimentell nachgewiesen 4000 im Zusammenhang mit Erkrankungen
• ein Drittel (1330) kommen als potentielle Targets in Frage

Question 24

RNAi

Wofür steht diese Abkürzung?

Answer 24

RNA inteference mittels siRNA oder miRNA

Question 25

Synthese von modifizierten NAs Welches Verfahren wird verwendet?

Answer 25

Phosphoamidit -Verfahren (siehe OC5 Kapitel 2)

Question 26

Wieviele Proteine können mit Wirkstoffen adressiert werden?

Answer 26

etwa 750 DURCH: 70% small molecules drugs 12% Biotech Drugs (basieren auf Nukleinsäuren oder Antikörper)

Question 27

metabolische Stabilität von Nucleinsäuren Welcher metabolische Abbau der RNA ist relevant? Wie funktioniert er?

Answer 27

RNA: Basenlabil Base greift OH Gruppe der RNA nucleophil an * cyclisches Intermediat * Spaltung Zu Zucker (3'Ende) und Neucleotid mit 5'Ende

Question 28

Zentrales Dogma und Intervention Wie beeinflusst RNAi die Proteinbiosynthese?

Answer 28

zellulärer Mechanismus Enzymkomplex mit katalytischer Aktvität * kann mit Nucleinsäure mit der codierenden Sequnzinformation auf mRNA eine Tagetsequenz finden * zerschneidet diese katalytisch

Question 29

Aptamere Defintion?

Answer 29

* Nucleinsäuren mit ausgeprägter 3D-Struktur, binden an bestimmte vorgegebene Liganden * Liganden werden generiert durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by exponential enrichment) * Funktionsweise mit Antikörper vergleichbar

Question 30

miRNA Entstehung? Bewirkt mit RISC?

Answer 30

* aus miRNA precursur \>DICER\>miRNA (teilweise ohne vollständige Basenpaarung) * bildet RISC Komplex * Bindung mit RISC an Target mRNA\> Translationsrepression

Question 31

siRNA-Medikamente Formulierung and Targeting

Answer 31

* Problem: "nackte" NA wird über die Niere ausgeschieden * Nanopartikel über die Leber \>Entwicklung von Medikamenten die in Cholesterol-Biosynthese eingriffen \>Medikamente gegen Lebertumore EPR-Effekt in Tumoren (enhanced permeability and retention):Blutgefäße im Tumor schlecht strukturiert (durchlässig mit vielen Löchern)\>Nanopartikel im Blutstrom werden herausgefiltert\>Anreicherung in löchrige Gefäße (aber Großteil geht immer noch in die Leber)

Question 32

Welche Nucleinsäuren haben eine antagonistische Wirkung?

Answer 32

* Bewirken eine Reduzierung der Proteinproduktion * antisense NA * siRNA * miRNA