Week 2 Flashcards

Question

Hoe vindt de DNA-replicatie in het kort plaats?

Answer 1

1. Begin op ‘replication origin’ (bepaalde volgorde van nucleotiden) bij herkenning van ‘initiator proteins’ 2. Aantrekking van eiwitten –> ontstaan eiwit complexen 3. DNA-helicase haalt de dubbele helix uit elkaar, ‘single strand binding protein’ beschermt enkelstrengs DNA 4. Sliding clamp zorgt dat DNA-polymerase aan DNA bindt hierin vindt replicatie plaats (in katalytisch centrum) 5. Replicatie door DNA-polymerase in replicatiegebieden (replicatievorken) van 5’ –> 3’ (leading strand) 6. Streng van 3’ –> 5’ (lagging strand) wordt in kleine stukjes van 5’ –> 3’ gemaakt en aan elkaar gezet door Okazaki-fragmenten, hierdoor is wel een RNA-primer nodig

Answer 2

- **Base selectie**: m.b.v. katalytisch centrum is DNA-polymerase in staat te bepalen welke nucleotide moet worden ingebouwd, hij wordt eerst gepast voordat het covalent wordt gebonden aan de primer (nauwkeurigheid 1 op 1000) - **Proofreading**: heel soms vindt er protonverplaatsing plaats (tautomere vorm) en wilt bijv. de C gaan binden met de A, DNA-polymerase maakt niet genoeg onderscheid hiertussen en bouwt hem in, echter vervalt het tautomeer en is de verkeerde nucleotide ingebouwd –> DNA-polymerase kan niet meer verder en dan is er 3’-5’ exonuclease activiteit (verkeerde base uit de streng knippen) –> DNA-polymerase kan weer doorgaan (nauwkeurigheid 1 op 1000) - **Mismatch reparatie**: MSH2, MLH1, MSH6 en PMS2 vinden de mismatch en trekken EXO1 aan, deze ‘eet’ de foute nucleotide en een paar eromheen op en het gat wordt weer gevuld door DNA-polymerase (als 1 vd eiwitten niet functioneren → dochtercellen met mutatie)

Answer 3

1. Immunohistochemische kleuring: gebruik maken van antilichamen en kijken of eiwitten van het reparatie systeem aanwezig zijn 2. Microsatellite instability assay (MSI): om wel aanwezige maar fout functionerende eiwitten te vinden, screening of het mismatch mechanisme werkt op gebieden in genomen (macrosatillite) die (mono-, di-, tri-) nucleotide repeats bevatten –> je krijgt bij replicatie erna of extra inbouw of deletie en dus wijzigt het aantal repeats (macrosatilllite zijn gevoelige delen in het DNA)

Answer 4

Het mismatch reparatiemechanisme werkt niet goed 1. Hogere proliferatieve activiteit van darmepitheel –> meer DNA-replicatie –> hoger foutenpercentage –> ontstaan poliepen - Lynch syndroom geassocieerde tumoren: CRC, baarmoeder, eierstokken, hogere urinewegen, maag, alvleesklier, galwegen, dunne darm, talgklieren, hersenen

Answer 5

75% sporadisch, 18% familiair belast, 5% Lynch syndroom, 1% FAP en 1% IBD Bethesda-criteria: - coloncarcinoom <50 jaar - tweemaal coloncarcinoom of CRC i.c.m. andere Lynch geassocieerde tumor bij 1 patiënt - coloncarcinoom met MSI <60 jaar - coloncarcinoom bij patiënt met 1 (<50 jaar) /2 (leeftijd onbelangrijk) eerste/tweedegraads familieleden met een CRC of Lynch syndroom geassocieerde tumor

Answer 6

- Lifetime risico op CRC tot 70%: vaak <50 jaar, meestal rechtszijdig (proximaal), in 25% meer dan 1 tumor bij diagnose - Lifetime risico op endometrium carcinoom tot 55%: - Lifetimerisico op andere geassocieerde tumoren 1-15% Daarom surveillance: vanaf 25 jaar 2x per jaar een colonoscopie van de gehele dikke darm, ook jaarlijks het endometrium screenen, ovarium (of andere plekken) screenen is niet zinvol –> frequentie laag, specificiteit en sensitiviteit testen laag en geen klinisch effect

Answer 7

Bij het vinden direct het hele colon eruit halen Als patiënt ouder dan 60 is, dan partiële colectomie door doordat overlevingswinst bij een totale gering is –> als Lynch met MSI is aangetoond dan werkt immunotherapie ook heel erg goed Preventief: je kunt je preventief laten opereren (colectomie en bijv. ook endometrium/ovarium), maar dit ligt aan de voorkeur van de patiënt –> je kunt je patiënt niet preventief chemo/bestraling geven

Answer 8

Dus bij geen aangetoond lynch syndroom Lifetime risk >10% dus vanaf 50 jaar 1x per 5 jaar een colonoscopie

Answer 9

- Eerstegraads familielid CRC <50 (indien dit aangedaane familielid zichzelf niet wil/kan laten verwijzen) - Drie of meer (eerste of tweedegraads) familieleden CRC (of een met lynch geassocieerde maligniteit) <70 - Kiembaanmutatie in 1 vd mismatch repair genen in de familie

Answer 10

Zie afbeelding voor overzichtelijke samenvatting!

Answer 11

BEP: combinatie van medicatie die breuken in het DNA veroorzaken - Bleomycine: dubbelstrengs DNA-breuken, concentreert oxidatieve radicalen dichtbij het DNA, bijwerking is verminderde longfunctie (>10%) - Etoposide: dubbelstrengs DNA-breuken, remt stap 5 van topoisomerase II (zie afbeelding) –> dubbelstrengs breuk met aan uiteinden covalent eiwit wordt niet meer aan elkaar gezet –> chromosomale afwijkingen –> teveel leidt tot apoptose - Cisplatine: interstrand crosslinks

Answer 12

Het uitschakelen van een reparatie pathway die in tumorcellen en normale cellen zit, dit was voor tumorcellen de enige manier, dus zij overleven dit niet Gewone cellen hebben nog een ander pathway en zullen zo toch overleven –> doel is namelijk tumorcellen uitschakelen en normale cellen behouden

Answer 13

- BER: Foute DNA eruit geknipt → polymerase vult dat weer op - Parp1: bindt aan enkelstrengs DNA breuk en gaat ketens van ADP residuen aan elkaar zetten (dit is een soort vlaggetje dat aan het DNA gehangen wordt). Hierdoor worden specifieke reparatie eiwitten aangetrokken → Efficiënte reparatie - Replicatie zorgt voor een dubbelstrengs breuk. NHEJ niet mogelijk. HR wel, hierdoor kan de replicatievork hersteld worden: Parp1-remmers: Enkelstrens DNA blijft langer open staan → hierdoor dubblestrengs breuken in cellen die het DNA repliceren → HR nodig In normale cellen is HR nog aanwezig en kan het reperareerd worden, in tumorcellen kan dit niet meer en zo gaan deze cellen dood

Answer 14

Dragers van BRCA1/-2 mutaties zijn heterozygoot en hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van kanker (borst, ovarium en prostaat) - Fenotype mutatie erft autosomaal dominant over **Ontstaan**: Inactivatie van het gezonde allel in kankercellen (LOH (verlies heterozygositeit)) –> deficiënt in homologe recombinatie **Behandeling**: behandeling met PARP1-remmers (efficiënte enkelstrengsbreuken reparatie verminderd) –> bij normale cel alsnog reparatie maar tumorcellen sterven (synthetische letaliteit)

Answer 15

1. Experimenten met cellijnen: bijv. kijken of cellen gevoelig zijn voor behandeling met PARP-remmers 2. Experimenten met dieren: in immuundeficiënte muizen menselijke tumoren inbrengen 3. Klinische studies: fase 1: onderzoek naar specificiteit, effectiviteit, farmacokinetiek, farmacodynamiek en dosering. Fase 2: met patiënten die uitbehandeld zijn. Fase 3: is het in de populatie ook echt zo

Answer 16

Afhankelijk van DNA-polymerase Q –> dit enzym kan ervoor zorgen dat een uiteinde gerepareerd wordt en hiervoor gebruikt hij een paar nucleotiden homologie om de uiteinden bij elkaar te krijgen en vult de rest verder in –> dus een alternatief als uiteindes richting homologe recombinatie gaan, maar dit niet helemaal voor elkaar krijgen

Answer 17

Doel: (Borstkanker) tumoren gevoelig maken voor PARP1-remmers door de tumor te verhitten en dus reparatie mogelijkheden te elimineren. Verhitten van een deel van het lichaam (de tumor) tot 42 graden voor 60-90 minuten –> hierdoor remming DNA-schade reparatiemechanismen en radiotherapie effectiever –> gedrag van RAD51 wordt bepaald door BRCA-1/-2, door radiotherapie hoopt RAD51 op maar door hyperthermie (afbraak BRCA) zal RAD51 hier niet meer ophopen –> soort synthetische BRCA-mutatie –> PARP1-remmer nu ook effectief

Answer 18

Er is sprake van complementariteit: A zit altijd met T en C altijd met G - dit omdat A en T 2 H-bruggen kunnen vormen en C en G 3 (sterkere verbinding)

Answer 19

NGS = het bepalen van de volgorde van de 4 nucleotiden basen waaruit het DNA molecuul bestaat Het detecteren van: - kleine mutaties (substituties van een aminozuur, deleties/inserties, etc.) - deleties en amplificaties - translocaties en fusiegenen

Answer 20

Doel: in kaart brengen van het volledige genoom door het DNA heel vaak te kopiëren Werking: 1. dubbelstrengs DNA-molecuul uit elkaar door temperatuurverhoging (>90 graden Celsius) 2. temperatuur omlaag –> complementaire primers (aan stukje template-DNA) toevoegen 3. basen worden toegevoegd 4. DNA-polymerase wordt toegevoegd 5. nieuwe DNA strengen worden gemaakt

Answer 21

- Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B) - Therapiekeuze (therapie A of B) - Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor) - Oncogenetica (vinden erfelijke tumorsyndromen) - Weefselidentificatie (onderscheid weefsel patiënten)

Answer 22

- Targeted NGS (amplicon enrichment): specifiek deel van het genoom sequencen, label aan de PCR-primer en hierdoor dezelfde gebieden van verschillende individuen bekijken –> efficiënt, maar 1 fragment uit een bepaald gebied wordt gesequenced - Hybridization enrichment: DNA in kleine fragmenten splitsen voordat het geamplificeerd wordt, hierna adapters voor latere sequencing toevoegen, interessante gebieden eruit halen (captured) en sequencen –> minder efficiënt, wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied → hierna bij beide: m.b.v. adapters moleculen binden aan een flowcell –> DNA-fragmenten vermeerderen –> clusters van dezelfde moleculen –> aflezen bouwsteenvolgorde tijdens de synthese (door vergelijking van sequenties achterhalen waar een gen van afkomstig is)

Answer 23

Op de flowcell worden de DNA-fragmenten geamplificeerd (vermeerderd), waardoor er clusters ontstaan van dezelfde moleculen. De daadwerkelijke sequencing vindt plaats tijdens de synthese. Elke nucleotide heeft een eigen kleur gelabeld die herkent wordt. Door vervolgens een fragment van de sequenties te vergelijken met het referentie DNA kan achterhaald worden van welk gen het afkomstig is. Wanneer de sequenties van verschillende patiënten vergeleken moeten worden, moet er een barcode aan geplaatst worden.

Answer 24

- Coverage (deep sequencing): hoeveelheid dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is, hoe hoger de coverga hoe meer gesequenced is en hoe nauwkeuriger het resultaat - VAF (variant allel frequency): aantal malen dat een DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. het referentie DNA (afhankelijk van gen en van tumor percentage)

Answer 25

- Vaak zit de mutatie maar op 1 van de twee allelen. Dus in sommige cellen is het gezonde allel geactiveerd en wordt er bij sequencing dus geen mutatie gevonden. - Ook wordt er in een biopt vaak naast tumorcellen ook gezonde cellen geoogst, deze gezonde cellen hebben ook niet altijd een mutatie. Hoe hoger het percentage tumorcellen in het biopt, hoe nauwkeuriger de uitspraak over de mutatie

Answer 26

- Single molecuul - Duizenden fragmenten/analyse - Output van 1-20 * 10^9 basen - Weinig DNA nodig (20 ng) - Hoge gevoeligheid (1-2%) - Poolen van samples (barcode) - Bio-informatica nodig

Week 2 Flashcards

(51 cards)