1
Q
Wat is leukemie en waardoor wordt het veroorzaakt?
A
-Leukemie = een ophoping van niet functionele cellen (meestal blasten) die de normale bloedcel vorming ernstig onderdrukken
- Veroorzaakt door mutaties in het DNA, deze zijn in ±50% van de gevallen microscopisch zichtbaar
2
Q
Wat verwacht je van het Lab en lichamelijk onderzoek bij (een verdenking op) CML?
A
LAB:
- Verhoogde witte bloedcellen
- Verhoogde bloedplaatjes
- Ery’s normaal, in ieder geval niet onderdrukt
LO:
Vergrote milt
3
Q
Wat is het verschil in bloedbeeld bij AML en CML?
A
AML
- Voornamelijk blasten in het bloed te zien, oftewel de cellen boven in het hematopoëtische schema.
- Dit zijn hele onrijpe cellen die zich niet meer kunnen ontwikkelen naar rijpe cellen
CML
- Alle stadia van het hematopoëtische schema zichtbaar in het bloed
- In het beenmerg een enorme verplaatsing van cellen naar de myeloïde reeks → worden granulocyten
- Heel veel megakaryocyten → daarom ook verhoogde bloedplaatsjes in het bloed
4
Q
Welk vervolgonderzoek wordt er gedaan als de anamnese en morfologisch onderzoek op een chronische myeloïde leukemie (CML) wijzen?
A
- Cytogenetisch onderzoek van beenmergcellen
- Moleculair onderzoek voor BCR-ABL fusiegen
5
Q
Welke 2 typen DNA-schade zijn er?
A
- Waarneembaar met een microscoop (50%): chromosoomafwijkingen
- Niet-waarneembaar met een microscoop (50%): puntmutaties, microdeleties, micro-inserties –> mutaties zijn recurrent
6
Q
Waarom is een karyogram maken bij een chronische myeloïde leukemie nuttig?
A
Alle mensen met CML hebben een afwijking; chromosoom 9 is langer (Philadelphia chromosoom) en chromosoom 22 wat korter (dus de 9;22 translocatie). Bij 95% van de patiënten is de mutatie ook waarneembaar.
7
Q
Wat is het fusiegen BCR-ABL?
A
Bij de 9;22 translocatie vindt er altijd een breuk bij introns bij genen BCR (22) en ABL (9) plaats en hierdoor ontstaat op het Philadelphia chromosoom (22) een nieuw fusiegen
–> na het weghalen van de intronen ontstaat fusie-mRNA en hierna wordt een nieuw fusie-eiwit (p210^BCR-ABL) gevormd
–> het gevormde eiwit is een enzym dat ATP kan binden en actief substraten gaat fosforyleren → de gefosforyleerde eiwitten gaan naar de kern en zorgen voor versnelde deling v/d gemuteerde cel
8
Q
Wat is het geneesmiddel voor chronische myeloïde leukemie (CML) en hoe werkt het?
A
Imatinib (Gleevec): tyrosine kinase inhibitor –> bindt op de plek (pocket) waar ATP in het BCR-ABL eiwit moet binden en inactiveert zo BCR-ABL
ATP kan niet meer binden → fosforylering stopt → cellen stoppen met delen
9
Q
Hoe kan tijdens de behandeling van CML met imatinib de leukemie toch weer terug komen en wat kan hieraan gedaan worden?
A
- Een mutatie in het ABL1 gedeelte van het BCR-ABL fusie-eitwit zorgt ervoor dat imatinib niet meer kan binden, maar ATP nog wel.
→ daarom bij resistentie dasatinib, nilotinib, bosutinib of ponatinib geven of een stamceltransplantatie
10
Q
Wat gebeurt er als je een CML niet zou behandelen of de tumor gemuteerd is en resistent is voor het medicijn?
A
Dan komt er een overgang van de acceleratiefase (CML) naar de blasenfase (AML) door additionele cytogenetische afwijkingen (mutaties)
11
Q
Wat zijn de kenmerken van acute myeloïde leukemie (AML)?
A
- Ophoping van onrijpe, niet functionele cellen (meestal blasten) die de normale bloedcelvorming onderdrukken
- Veroorzaakt door mutaties in DNA (>50% onder microscoop waarneembaar)
- Heterogene ziekte: verschillende mutaties (en combinaties hiervan) veroorzaken de ziekte –> beloop verschilt hierdoor enorm –> patiënten o.b.v. mutatie onderverdelen in subtypes
Onderscheid tussen prognose en behandeling op basis van karyotypering:
- Translocaties t(8;21) en t(15;17) → goede prognose, behandeling met chemo
- Chromosoom 7 afwijking → slechte prognose, behandeling chemo + stamceltransplantatie
12
Q
Waaruit bestaat het DNA?
A
- Genen (ongeveer 2% van het totale DNA)
- Centromeer (wordt op het einde verdubbeld en zit tussen de chromosomen in)
- Telomeren (uiteinden)
→ elke cel bevat ong. 2m DNA ingepakt in een kern van 10 micrometer in doorsnede (DNA wordt opgerold om histonen)
13
Q
In welke 4 stappen is de celcyclus ingedeeld?
A
G1: celgroei, van elk chromosoom 1 kopie aanwezig
S: verdubbeling DNA, elk chromosoom heeft twee chromatiden
G2: klaarmaken voor mitose, controle of alles goed verdubbeld is
M: uitverdeling van de chromosomen over de dochtercellen (mitose), dochtercellen weer naar G1 fase
14
Q
In welke fasen is de mitose ingedeeld?
A
- Profase: oprollen van het DNA om de histonen (condenseren) tot losse chromosomen
- Prometafase: Kernenvelop wordt afgebroken zodat chromosomen los komen te liggen in het cytoplasma, chromosomen vastgemaakt aan tubuline draden
- Metafase: chromosomen liggen geordend in het midden van de cel
- Anafase: chromosomen worden uiteen getrokken naar 2 tegenovergestelde polen, hierdoor worden de chromosomen verdeeld over de dochtercellen
- Telofase: rondom het afzonderlijke DNA worden nieuwe kernenveloppen aangelegd. Het DNA gaat zich weer concentreren (decondenseren)
- Cytokinese: vorming van 2 cellen. Nadat de kernen gescheiden zijn, deelt ook het cytoplasma zich op
15
Q
Hoe worden de chormosomen uit elkaar getrokken tijdens de metafase?
A
Centrosoom wordt verdubbeld in de S-fase → in de mitose gaan beide centrosomen uit elkaar en verplaatsen zich naar tegenovergestelde polen → vanuit de centrosomen groeien tubuline draden die vastgehecht raken aan de chromosomen (kinetochoor) → hierna kan de anafase beginnen
16
Q
Welke technieken zijn er om chromosomen te kunnen zien?
A
- Alle chromosomen aankleuren (bijv. R Bandering)
- In situ hybridisatie (FISH) (kijken naar een specifiek gen)
- Chromosoom specifieke probes (FISH) (kijken naar een specifiek chromosoom)
- Spectrale Karyotypering (SKY)
17
Q
Wat is een Karyogram en wat kun je ermee?
A
Alle chromosomen op een rijtje van groot (1) naar klein (22) met de X en X/Y
–> je kunt afwijkingen ontdekken als bijv. de lengte van chromosomen afwijkt
18
Q
Welke structurele chromosomale afwijkingen zijn te onderscheiden?
A
- Deleties: verdwijnen stuk chromosoom
- Translocaties: stuk chromosoom wordt aan een ander chromosoom gezet (CML)
- Dicentrische chromosomen: er liggen 2 centromeren op 1 chromosoom
19
Q
Hoe ontstaat een dicentrisch chromosoom?
A
Tijdens de metafase worden de chromosomen uit elkaar getrokken, echter kan het dat de tubuli bij het kinetochoor aan de verkeerde kant is vastgemaakt –> hierdoor trek je van 2 verschillende kanten aan het chromosoom en krijg je een 4endeling waarna het chromosoom vaak breekt (dit moet dan weer hersteld worden)
Je ziet dit veel na bestraling, na een aantal keer delen zullen er deleties/translocaties optreden waardoor er geen dicentrische chromosomen meer zijn, maar wel fouten in het DNA
20
Q
Hoe ontstaan numerieke afwijkingen in het DNA?
A
Chromosoom verlies/duplicatie (aneuploïdie)
Tijdens de metafase van de mitose: alle chromosomen moeten aan 2 centromeren worden gemaakt en pas dan kan de anafase beginnen (tijdens metafase zendt kinetochoor signaal uit als niet alles vastzit) –> als een chromosoom niet vast zit voor de verdeling begint kan er een teveel of te weinig in een cel komen (non-disjunctie) –> er zitten dan 3 in de ene cel en 1 in de andere cel
21
Q
Hoe kun je numerieke afwijkingen herkennen?
A
- Karyogram
- Analyse van (CA)n repeats: in veel chromosomen vindt je CA repeats (veel = lange band in PCR, weinig = korte band), 2 allelen dragen verschillende hoeveelheden repeats (1 van vader, 1 van moeder), als er maar 1 band te zien nis dan ontbreekt er 1 allel en dus 1 chromosoom
- Next generation sequencing (NGS): verlies van single nucleotide polymorphisms, basenparen normale plaats cellen vergelijken met tumorcellen
22
Q
Hoe ontstaat een deletie?
A
Eerst een dubbelstrengs breuk in het DNA, hierna gaat het de mitose in; chromosomen worden netjes uitverdeeld alleen het deel aan de centromeer wordt netjes uitgelijnd terwijl het andere stukje niet verdeeld wordt (komt ergens middenin de cel terecht) –> na de mitose zal dit stukje in het cytoplasma van 1 van de dochtercellen circuleren en daar zal een micronucleoli (microkern) omheen gevormd worden –> meestal gaat het stukje hierna helemaal verloren
23
Q
Wat gebeurt er bij chromothripsis?
A
Chromosomen breken in kleine stukjes en worden weer aan elkaar gezet in de verkeerde volgorde –> hierdoor meerdere transversies in 1 cel (vergevorderd stadium van kanker)
24
Q
Hoe verloopt het proces van genamplificatie en wat zijn de gevolgen?
A
Soms wordt het chromosoom in de S-fase vaker verdubbeld waardoor meerdere kopieën van een gen ontstaan (genamplificatie), dit kan als een origin of replication niet stopt –> dit is zichtbaar als homogeen gekleurde gebieden in chromosomen
–> soms kan het uit het chromosoom springen (dan krijg je kleine losse chromosoompjes) en krijg je ‘double minute’ chromosomen wat mogelijk een groeivoordeel van de tumor kan opleveren
25
Welke genetische fouten kunnen bijdragen aan tumorigenese?
Activering van oncogenen door:
- translocatie
- verdubbeling chromosoom
- genamplificatie
Inactivering van tumor suppressor genen door:
- deletie
- verlies van chromosoom
26
Wat is de functie van telomeren?
Uiteinde van DNA (dubbelstrengs breuk) en zorgen voor bescherming
–> als het misgaat en het einde wordt herkend als een breuk kunnen dicentrische chromosomen ontstaan (bij reparatie door niet-homologe end-joining) waardoor er genomische instabilieit komt –> dit wordt voorkomen door de T-loop en eiwitten waardoor het niet herkenbaar is
27
Welke functies hebben de telomeren nog meer naast dicentrische chromosomen voorkomen?
Ze beperken de celgroei
- Na elke deling verkorten de telomeren (in stamcellen m.b.v. telomerase wel in stand gehouden) en als ze te kort dreigen te worden geven ze een signaal af (M1 Hayflick Limit), als ze hierna nog een paar keer delen zijn de telomeren echt te kort (M2-crisis) en ontstaat chromosomale instabiliteit met celdood als gevolg
28
Waardoor kunnen tumorcellen door blijven delen ondanks de telomeren?
Door een alternatieve telomeerverlenging
- 85-90% van de tumoren brengt telomerase tot expressie
- Het andere percentage heeft nog andere mechanismen (ALT)
–> een telomerase-remmer is niet de ultieme oplossing, omdat hij ook het ALT-mechanisme aan kan zetten en er zo weer aan kan ontsnappen
29
Waarom doe je genetisch onderzoek bij hematologische maligniteiten?
- Relevant voor de diagnose: sommige mutaties zijn bijv. altijd CML/AML ook al presenteert het zich anders
- Belangrijk voor bepaling van prognose: bepaalde mutaties hebben standaard een goede/slechte prognose
- Gerelateerd aan de reactie op chemotherapie
- Identificatie van betrokken genen: vertelt wat over de leukemogenesis en hematopoëse
–> bij 50% v.d. patiënten met AML geen afwijkingen in chromosomen, alleen moleculaire afwijkingen (11% complex karyotype, 23% zowel chromosomaal als genetische afwijkingen)
30
Waarmee vindt detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen plaats?
- Klassieke cytogenetica: banderingstechnieken
- Moleculaire cytogenetica: fluorescente in situ hybridisatie (FISH) en Array (SNP array)
- Moleculaire diagnostiek: RQ-PCR (fusiegenen), Q-PCR en Sequencing (Sanger of NGS)
31
Hoe vindt het kweken van cellen voor cytogenetisch onderzoek plaats?
1. Beenmerg en bloed als kweekmedium en hieraan groeifactoren toevoegen om leukemische cellen te triggeren om te delen (1-2 dagen)
2. Met een colcemid de celdeling stopzetten (mitose blok) en dus chromosomen tijdens de metafase bevriezen (half uur)
3. Hypotone oplossing toevoegen waardoor cellen zwellen en kapot gaan
4. Kapotte cellen (met celkern en celdeling) fixeren met methanol-azijnzuur waardoor het membraan ontvet wordt
5. Suspensie op het glaasje druppelen waardoor membranen breken
6. Kleuring en bandering (R-, G- of Q-bandering) waarna er een (unieke) streepjescode op elk chromosoom te zien is
32
Welke typen chromosomale afwijkingen zijn er?
Numerieke afwijkingen:
- Winst (compleet chromosoom)
- Verlies (compleet chromosoom)
Structurele afwijkingen:
**Gebalanceerd**: delen uitgewisseld, maar nette niets verloren
- Translocatie: 2 stukken chromosomaal materiaal uitwisselen
- Inversie: stuk chromosoom is 180 graden gedraaid (aan P- (korte) of Q-arm (lange) = paracentrisch, of rondom centromeer = pericentrisch)
- Insertie: interstitieel stukje verplaatst
**Niet-gebalanceerd**:
- Deletie: deel chromosoom verloren, terminaal (einde) of interstitieel (midden)
- Amplificatie: duplicatie
- Niet-gebalanceerde translocatie
- Gen mutatie: basenpaarniveau
33
Wat zijn belangrijke kenmerken van het chromosoom?
- P-arm: korte arm, hebben chromosoom 13,14,15,20&21 niet zij hebben een repititieve - DNA-sequentie voor ribosomaal DNA (bij een translocatie gaat dit verloren, maar geen gevolg omdat dit vaker aanwezig is)
- Q-arm: lange arm
- Centromeer: insnoering
- Banden: geven gebieden op het chromosoom weer, zijn genummerd
34
Hoe wordt een beschrijving van het karyogram weergegeven?
Eerst chromosomenaantal, dan geslacht en dan bijzonderheden: bijv. 45, XY, -7[10]
–> chromosoom 7 mist in 10 metafasen bij een mannelijk karyotype
Breekpunten worden als volgt aangegeven; t(9;11)(p22;q23)
–> translocatie van chromosomen 9 en 11, op chromosoom 9 zit het breukpunt op P-arm op plek 22 en bij chromosoom 11 op Q-arm op plek 23
35
Wat zijn AML slecht en goed risico afwijkingen?
Slecht risico: complex karyotype, monosomaal karyotype (2 autosomale monosomieën (verlies) of 1 verlies en 1 structurele afwijking) (zeer slechte overall survival van 7% ondanks allogene stamceltransplantatie)
Goed risico: (t8;21), inv(16)
Zie ook de afbeelding!
36
Wat is FISH (fluorescence in situ hybridization) en wat zijn de voor- en nadelen?
Methode om mutaties zichtbaar te maken: onderzoek gericht op een specifieke target (bijv. plek x op chromosoom x) en hierdoor beperkt
1. DNA wordt gesmolten door te verwarmen waardoor de strengen uit elkaar gaan
2. Een stukje enkelstrengs DNA (probe) wordt eroverheen gewassen wat hecht aan het uiteengesmolten DNA
3. Probe wordt gebruikt om aan te tonen of het stukje DNA wel/niet aanwezig is in de patiënt
4. Een fluorescerend label wordt aan de probe geplakt zodat hij terug te vinden is
–> kan bij gekweekte/delende cellen (metafase FISH) en niet/slecht delende cellen (interfase FISH)
**Voordelen**: detectie microdeleties, breukpunt detectie en verbetering, detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen, snelle diagnostische detectie op kernen in interfase, kleine hoeveelheid afwijkende cellen zichtbaar
**Nadelen**: gelimiteerde sensitiviteit, beperkte target locaties, alleen antwoord op welke vragen je stelt
37
Welke verschillende FISH probe designs worden gebruikt?
- Fusion probes: voor translocaties aan te tonen, fusiesignaal is geel (rood+groen), wel een probleem als rood boven groen ligt (3D-structuur) want dan krijg je onterecht geel
- Break-apart probes: als er een breuk tussen 2 stukken komt, bij geen translocatie dan 2 fusies (2x geel), bij een translocatie is er 1 fusie en ook 1 groen-rood signaal
38
Waarom is er bij een multiple myeloom (MM) een probleem bij chromosoomonderzoek en wat is de oplossing hiervoor?
Afwijkende cellen komen niet in deling, dus klassieke technieken leveren een normaal karyotype op en een aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch)
Oplossing: hoger % plasmacellen nodig dus zuivering van plasmacellen
1. rode bloedcellen verwijderen uit beenmerg door rode bloedcel lysis
2. antilichamen maken tegen CD-138 (buitenkant plasmacellen) waaraan beads (magneten) worden gekoppeld
3. CD-138 met het antilichaam laten binden en er een magneet bij houden waardoor de beads samen met de plasmacellen hangen aan de magneet en ze alleen overblijven
39
Wat is de SNP-array (single nucleotide polymorphism)?
Genoom-breed kijken en fouten met kleine resoluties in kaart brengen
- Onderzoek met 850.000 probes
- Testen of iemand voor een bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is
- Analyse m.b.v. LogR (maat voor aantal kopieën) en B-allele frequency (frequentie van de SNP)
1 allel zichtbaar = depletie, 3 allelen = duplicatie, 2 allelen maar alleen AA en BB zichtbaar (niet AB) = verlies heterozygositeit
In de praktijk: geen 100% zuivere populatie, dus ook normale cellen erdoor die interfereren
40
Wat zijn de verschillen in detectiemogelijkheden tussen FISH en SNP-array
Bij beide zichtbaar: winst van een heel chromosoom, deleties, gains
Bij FISH: translocaties zichtbaar
Bij SNP-array: verlies van heterozygositeit zichtbaar
41
Uit welke 4 fasen bestaat de celcyclus?
- G1-fase: celgroei en beslissen en restrictiepunt: kiezen om te delen of niet
- S-fase: duplicatie van chromosomen
- G2-fase: voorbereiding op de celdeling
- M-fase: celdeling naar 2 dochtercellen
42
Wat zijn de 3 belangrijkste klassen genen van de celcylus?
- Cyclines
- Cycline afhankelijke kinases (CDKs)
- Cycline afhankelijke kinase remmers (CKIs)
43
Welke cyclines zijn er en wat is hen functie?
Cyclines: zijn gedurende bepaalde stadia van de celcyclus actief en controleren de voortgang van de celcyclus:
- Cycline D: tijdens G1-fase actief, zorgt voor activatie van celcyclus na G1 (na groeisignaal)
- Cycline E: overgang van G1- naar S-fase en voortgang S-fase
- Cycline A: tijdens S-fase actief, zorgt voor progressie S-fase
- Cycline B: tijdens G2-fase actief, zorgt voor overgang naar M-fase
44
Wat zijn de cycline afhankelijke kinase (CDKs) en -remmers (CKIs)?
Cycline afhankelijke kinase (CDK): zijn continu aanwezig en zijn alleen actief als ze met cycline binden
- fosforyleren eiwitten die nodig zijn voor celcyclus progressie
- CDK4 bindt aan cycline D en CDK2 bindt aan cycline E en A
Cycline afhankelijke kinase remmers (CKI): binden aan Cyc/CDK-complexen en remmen de kinase activiteit
- Met name actief in de G1-fase (na signalen van buiten de cel of na DNA-schade)
- CKI p16ink4a remt cycline D (met CDK4) en CKI p21 remt cycline A en E (met CDK2)
45
Wat zijn celcyclus checkpoints?
DNA mag alleen gerepliceerd worden als er geen beschadigingen zijn, rondom de checkpoints wordt gecontroleerd op beschadigingen/afwijkingen:
- Restrictie-punt: besluit van wel of niet delen/specialiseren (RB)
- G1/S-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (P53)
- Intra S-fase-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is (ATM)
- G2/M-checkpoint: kijken of DNA beschadigd is en of het volledig gerepliceerd is
- Anafase-checkpoint: kijken of de chromosomen goed gerangschikt zijn (BUB1)
46
Hoe werkt de signaaltransductie voor celdeling van een cel?
1. Groeifactoren binden aan een groeifactor-receptor op het celmembraan
2. Signaaltransductieroute in gang gezet –> signaal doorgeven van cytoplasma naar kern
3. Activatie cycline D
4. Binding van cycline D aan CDK4 zorgt voor een actief complex –> fosforylatie van eiwitten waaronder E2F waardoor het loskomt van het gefosforyleerde RB-eiwit
5. E2F is een transcriptiefactor die cycline E voor de S-fase aanzet en p16-eiwit activeert waardoor cycline D activiteit geremd wordt (terugkoppeling)
47
Hoe werkt het G1/S checkpoint?
Als DNA beschadigd raakt in een normale cel gaat het p53 eiwit omhoog (tumor suppressor eiwit) –> hierdoor wordt p21 (CKI) afgeschreven en wordt het cycline E/CDK2-complex geremt –> geen overgang van G1- naar S-fase (G1/S-arrest)
In een mutant p53 cel gaat het niveau niet omhoog en zal er geen G1/S-arrest plaatsvinden en gaat het beschadigde DNA naar de S-fase om gerepliceerd te worden –> replicatie van beschadigd DNA wat kan worden omgezet naar mutaties –> risicofactor voor kanker
48
Hoe werkt het intra S-checkpoint?
In een normale cel wordt bij DNA-beschadiging het ATM (tumor suppressor gen) geactiveerd –> ATM activeert CHK2 wat cycline A/CDK2-complex inactiveert –> synthese van DNA in S-fase geremd
In een mutante ATM cel zal cycline A/CDK2-complex niet worden geremd –> replica beschadigd DNA –> omgezet naar mutaties en risicofactor voor kanker
- Bij een geboren ATM-defect de ziekte van ataxia telangiectasia (AT): overgevoeligheid voor röntgenstraling en kankerpredispositie
- Defect intra S-checkpoint kan worden gemeten via radioresistente DNA-synthese (RDS), na röntgenbestraling voeg je een radioactieve bouwsteen van DNA (3H-Thymidine) toe die ondanks DNA-schade wordt ingebouwd, in de controle cel zal DNA-synthese wel geremd worden een geen inbouw van 3H-Thymidine
49
Hoe werkt het anafase checkpoint?
Vindt eigenlijk plaats tijdens de metafase!
Tijdens mitose binden microtubuli aan het kinetochoor en centrosoom (vorming mitotische spindle) –> centrosomen trekken chromosomen uit elkaar en in kinetochoor zitten spanningsgevoelige eiwitten (MAD1, BUB1) die decteren of microtubuli gebonden zijn en op spanning staan –> bij een fout wordt het proces gestopt
Als het anafase checkpoint defect is wordt het chromosoom (2 zusterchromatiden) naar 1 dochtercel getrokken en ontstaat aneuploïdie: extra chromosoom in een dochtercel
50
Wat is er aan de hand bij het Nijmegen breuk syndroom (NBS)?
Niet goed werken van de anafase-checkpoint
Patiënten hebben; microcephalie, groeiretardatie, intellectuele achterstand, immuundeficiëntie, stralingsgevoeligheid, chromosomale instabiliteit, kanker predispositie, etc.
- Ziekte erft autosomaal recessief over met mutatie in het Nbs1 of RAD50 gen
Geeft net als AT een RDS fenotype
51
Wat doen de Nbs1 en RAD50 genen?
Binden aan dubbelstrengs DNA-breuken om strengen bij elkaar te houden –> voor het herkennen is ATM-kinase nodig (verhoogde CHK2 activiteit –> inactivatie cycline A/CDK2-complex –> DNA-synthese remmen)
In afwezigheid van Nbs1/RAD50 wordt DNA-synthese niet geremd en ontstaat een RDS-fenotype in AT-cellen (geen ATM-kinase aanwezig) –> hierdoor ontstaat verkeerd herstel van dubbelstrengs breuken wat leidt tot translocaties en genomische instabiliteit
52
Uit welke componenten bestaat het humane genoom?
- Nuclear genome (kern-DNA): 16,5 kilobasenparen, maximaal 1000 kopieën per cel, <1% van het totale DNA, circulair
- Mitochondrial genomes (mitochondriaal-DNA): 3 miljard basenparen lang (haploïd), 50-250 Mb per chromosoom (1,7-8,5 cm lang)
53
Hoe wordt de sequentie van het menselijk genoom bepaald?
1. Isoleren DNA
2. Kloneren DNA (m.b.v. bacteriën)
3. Delen van het DNA ordenen op plekken van het chromosoom
4. Specifiek deel van het DNA in kleine stukjes knippen
5. Sequencen van kleine stukjes DNA, waarna ze weer in de goede volgorde gezet worden (overlap op strengen)
54
Wat zijn de volgende aantallen:
1. Aantal eiwit coderende genen in het genoom
2. Aantal RNA-only genen
3. Percentage dat bestaat uit coderende sequenties
4. Percentage dat bestaat uit hoog repetitief DNA afkomstig van transposable elementen (elementen die toevallig in het genoom zijn gekomen) ?
1. 19.846 genen (1,5x zoveel als fruitvlieg, 3x zoveel als bakkersgist –> proteoom is wel veel complexer dan dat van intervertebrale organismen)
2. 26.350 genen (functie niet volledig opgehelderd)
3. 1,5% (omdat meeste delen veel/grote intronen bevatten wordt ten minste 33,3% wel getranscribeerd)
4. 50% van het genoom (transposon activiteit bijna helemaal verloren, daarom op een vaste plek blijven zitten)
55
Hoe erg is het humane genoom gelijk met dat van andere zoogdieren?
DNA-verschil tussen 2 mensen: 1 verschil per 1000 basen (SNP) = 0,1% (zo’n 3 miljoen basenparen)
DNA-verschil tussen mens en chimpansee: 1 verschil per 100 basen = 1%
–> disclaimer: grootte genoom bepaald niet complexiteit van het organisme
56
Waarbij wordt humane genoomsequentie toegepast?
- Identificeren en kloneren van ziektegenen (inc. oncogenen zoals BRCA2 en XLP)
- Identificeren van nieuwe genen die verwant zijn aan bekende drug targets (mogelijkheid nieuwe farmacologische stoffen te ontwikkelen/oude te verbeteren)
- Vinden van mutaties die overgevoeligheid voor medicijnen veroorzaken (hierdoor dosis aanpassen en risico bijwerkingen terugbrengen)
57
Hoe verloopt een cDNA microarray?
Door combinaties van bepaalde regulatie-eiwitten met cellen ontstaan verschillende soorten celtypen (400 verschillende in het lichaam) –> te onderscheiden door naar genexpressie in celtypen te kijken
Microarray:
1. Isoleren RNA uit tumor en gezond weefsel
2. Analyse m.b.v. microarray analyse, 3 opties:
* Geen oplichting: geen genexpressie
* Gele uitslag: genen even hart tot expressie in beide weefsels
* Groene/rode uitslag: genen komen in het gezonde weefsel meer tot expressie dan in het tumor weefsel (groen) of andersom (rood)
3. Data analyseren m.b.v. bioinformatica
4. Validering van microarray analyse: m.b.v. western blot of PCR
5. Inzicht in genen en moleculaire processen (–> voor diagnose, prognose en individuele behandeling te verbeteren)
58
Waarom is microarray belangrijk bij DLBCL (diffuse large B cell lymphoma)?
DLBCL: grote laesies op de huid
- M.b.v. cDNA microarray kan onderscheid worden gemaakt tussen 2 vormen (germinal centre B-like DLBCL, activated B-like DLBCL), deze hebben een hele andere prognose waardoor ook de behandeling anders ingesteld kan worden
59
Hoe wordt Next Generation Sequencing (NGS) toegepast?
Voor €1000 het complete genoom van een individu sequencen
- genoom individu vergelijken met referentiegenoom: varianten in eiwit coderende exonen, varianten die genexpressie beïnvloeden en genduplicaties, kleine deleties en inversies in kaart brengen
- gebruikt voor het voorspellen van eigenschappen: oogkleur, ziekterisico, verslaving
- ong. 44% v.d. genen zijn heterozygoot voor 1/meerdere varianten (invloed op het eiwit wat het codeert)
- in de praktijk: opsporen mutaties, sequensen RNA om genexpressie profielen te bepalen, mRNA sequensen
60
Welke informatie kan er in de praktijk uit een NGS gehaald worden?
- dynamisch bereik (moleculen tellen)
- gebruik alternatieve promotoren onderzoeken
- alternatieve splicing onderzoeken
- allel-specifieke genexpressie onderzoeken
- mutaties detectie
- ontdekken van nieuwe exons, niet-coderend RNA en microRNA
61
Wat is de circadiane klok en hoe werkt licht-resetting hiervan?
De menselijke interne klok heeft een omlooptijd van 25 uur –> als je het niet reguleert zou je iedere dag een uur later gaan slapen
- stelt lichaamsfuncties in staat te anticiperen op de specifieke behoefte op bepaalde momenten van de dag
- de klok van de aarde loopt maar tot 24 uur, daarom is er licht, dit zorgt ervoor dat het lichaam gelijk blijft lopen met het ritme van de dag (licht-resetting); bij een lichtpuls vlak voor het einde van de nacht komt er een vervroeging van de activiteit (fase-advance) en vlak na het begin van de nacht zorgt dat al het gedrag uitgesteld wordt (fase-delay) (zichtbaar te maken met een phase-response curve)
62
Waar zit onze interne klok?
Licht komt binnen in de fotoreceptoren in het oog, in de neuronen van de suprachiasmatische nucleus (SCN) (ook beïnvloedbaar door blauw licht) zit de centrale klok die gesynchroniseerd is met de aardse dag-nacht cyclus voor licht –> als je dit centrum kapot maakt zal het lichaam niet langer een ritme hebben
63
Welke genen zijn betrokken bij de circadiane klok en wat gebeurt er als je de betrokken genen uitschakelt?
Cryptochroom 1 en 2 zijn de betrokken genen
- Uitschakelen Cry1-gen: sneller tikken interne klok (22.51 uur)
- Uitschakelen Cry2-gen: langzamer tikken interne klok (24.63 uur)
- Cry1- en Cry2-gen uitschakelen: compleet ontspoorde interne klok
64
Hoe werkt de circadiane klok?
Raderwerk van klokgenen en klokeiwitten die elkaar periodiek aan- en uitschakelen
Cry-genen worden vanaf e-box promotor afgeschreven
- negatieve loop (core loop): cryptochroom eiwitten gaan terug naar de kern, zorgen voor cyclische remming door remmen van transcriptiefactoren Clock en Bmal1 via de vorming van een CRY/PER complex
- positieve loop (stabiliserende loop): Bmal1 activatie via Rev-Erba
Dit proces zit in iedere perifere cel (licht onafhankelijk) en worden iedere dag gelijk gezet door stimuli uit de SCN (bijv. hormonen of neutrale stimuli) (cellen die wel licht afhankelijk zijn)
Zie ook de afbeelding!
65
Waar hangt de stabiliteit van de eiwitten in de circadiane klok vanaf?
Van posttranslationele modificatie (fosforylering, ubiquilering of acetylering) van PER- en CRY-eiwitten –> hiermee wordt de timing van de klok beïnvloed
66
Wat is het chronotype van de circadiane klok?
Ieder heeft zijn eigen chronotype wat aangeeft of je meer een ochtend- of avondmens bent
- Ochtend mensen: snellere klok
- Avond mensen: langzamere klok
–> koppeling klok met gedrag en metabole processen verloopt via klok-gecontroleerde genen (CCG’s) die ritmisch tot expressie komen
67
Hoe kun je kort samenvatten wat de centrale en perifere klok zijn?
De centrale klok zit in de zenuwcellen van de SCN en wordt iedere dag gelijk gezet met de licht-donkercyclus door licht
In overige cellen zitten de **perifere klokken**. Deze worden iedere dag gelijk gezet door de stimuli uit de SCN. Ze hebben dezelfde set klokgenen als de centrale klok.
Iedere cel in het lichaam heeft dus een klok. Cellen in kweek krijgen geen stimuli meer uit de SCN waardoor de klokken desynchroniseren.
68
Wat is de invloed van de circadiane klok op de genen?
Per orgaan 10-20% van alle actieve genen o.i.v. circadiane klok –> temporele organisatie aan het lichaam
Verschillende genen hebben een verschillende piekactiviteit op verschillende momenten van de dag (zie afbeelding!)
Het stelt ook de lichaamsfuncties in staat om te anticiperen op verschillende behoeften op bepaalde momenten van de dag, hij is ook evolutionair geconserveerd
69
Wat zijn acute en langdurige klachten van een circadiane desynchronie?
Als er een verschil in lichaamstijd en geografische tijd is (jetlag, nachtdiensten)
- Acuut: slaaptekort, vermoeidheid, minder alert, lager prestatievermogen
- Chronisch: metabole verstoringen (hoger risico op diabetes, HVZ en obesitas), versnelde tumorinductie en veranderd tumorspectrum (Vaker kwaadaardig), risicofactor voor borstkanker
70
Waarom moet je bij het geven van medicatie rekening houden met de circadiane klok?
Een medicijn moet geAbsorbeerd worden, geDistrubeert, geMetaboliseerd en geËlimineerd (ADEM) –> de organen die het medicijn hiervoor passeert hebben allemaal hun eigen klok en beïnvloeden hiermee de werking
- Tamoxifen: behandeling borstkanker, 1x per dag innemen maar uit onderzoek blijkt dat het beter is om het ‘s ochtends in te nemen
- Medicijnen met chronotoxiciteit (toxisch effect afhankelijk van tijdstip van blootstelling) (bijv. die kunnen zorgen voor DNA-beschadigingen) wil je ook op bepaalde momenten op de dag (niet) geven
71
Hoe is de celcyclus gekoppeld aan de circadiane klok?
Circadiane klok en celcyclus zijn fase-gekoppeld (bidirectioneel: resetting klok door cyclus): cellen delen altijd op hetzelfde moment op de dag (niet alle cellen allemaal, maar elke cel heeft zijn eigen moment)
- meestal 20 uur tussen de 2 celdelingen, in een rustende cel is dit 25 uur
72
Wat is de relatie tussen tumorcellen en de circadiane klok?
Veel chemotherapeutica werken op delende cellen alleen de deling van tumorcellen loopt asynchroon met de celcyclus omdat ze op ieder moment van de dag kunnen delen
–> chronotherapeutica werken het best als ze door het hele lichaam worden getolereerd daarom moet eerst worden gekeken hoe de interne klok van de patiënt in elkaar zit (chronotype) daarna kunnen chemo’s hierop afgesteld worden dat ze zo min mogelijk gezonde cellen beschadigen
73
Welke checklist is er om te kijken of een geneesmiddel potentieel chronotherapeutisch is?
Chronotherapeutica werken het efficiënst op het moment dat zij het beste door het lichaam worden getolereerd.
- Vertonen de symptomen van de ziekte significante circadiane variatie? (astma, hartinfarct)
- Is de farmacokinetiek van het geneesmiddel afhankelijk van het tijdstip van toediening?
- Vertoont het doelorgaan circadiane variatie in de gevoeligheid voor het geneesmiddel?
74
Wat is proteomices?
Techniek waarmee je de eiwitten van een cel kunt bestuderen
- hoeveelheid (actie) eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA (mRNA zorgt namelijk voor meer dan alleen genexpressie)
- op basis hiervan een expressieprofiel van eiwitten maken (kost tijd, maar met verbeterde technieken mogelijk
- mogelijkheden voor analyse: eiwitidentificatie, eiwitmodificatie, eiwit-interacties tussen eiwitten
75
Wat kan een massaspectometrie m.b.t. eiwitten?
- Eiwitten identificeren
- Eiwitten kwantificeren (iets moeilijker)
- Bindende eiwitten identificeren
- Eiwitmodificaties identificeren (fosforylering, acetylering, methylering, etc.)
76
Hoe analyseert een massaspectometrie de massa van een eiwit?
1. Op de massaspectometer (lange buis met een plaat) wordt het eiwitmengsel aangebracht
2. Plaat wordt met een laser geschenen
3. Eiwitten worden positief geladen doordat elektronen wegschieten
4. Positief geladen peptiden gaan bewegen richting de negatieve pool –> snelheid is afhankelijk van de grootte (kleiner = sneller)
5. Peptiden worden geregistreerd als ze langs de detector plaat komen en hier kan de molecuulmassa (op meerdere cijfers achter de komma, anders kun je niet het aantal aminozuren berekenen) en relatieve hoeveelheid van het eiwit aangeduid worden
77
Hoe kun je m.b.v. een massaspectometrie de structuur van een eiwit achterhalen?
Zie afbeelding!
Uit de massaspectometrie komt een lijst van molecuulmassa’s die in het sample zaten, m.b.v. een computer maak je van alle mogelijke eiwitten een lijst van alle mogelijke tryptische fragmenten en bereken je hier de molecuulmassa’s van
–> neem je deze gegevens samen dan kun je de eiwitten identificeren
78
Hoe verloopt de eiwit identificatie m.b.v. een massaspectometrie?
1. Een mengsel van eiwitten in kleine stukjes knippen m.b.v. trypsine (protease uit de darmen, knipt voor een arginine (R) of lysine (K))
2. Kleine stukjes eiwitten (peptiden die beginnen met K of R –> tryptische fragmenten) analyseren op massa
3. Analyse vergelijken met wat men verwacht a.d.h.v. het genoom –> eiwit identificeren
79
Hoe identificeer je m.b.v. een massaspectometrie welke eiwitten binden aan het eiwit van interesse?
1. Aan het mengsel een antilichaam voor het eiwit naar interesse toevoegen
2. Eiwit van interesse (met andere gebonden eiwitten) zal aan het antilichaam binden
3. Eiwitten die niet hebben gebonden wegwassen
4. M.b.v. een massaspectometrie de eiwitten in kaart brengen en de eiwit-interacties ophelderen
→ kan voor verschillende eiwitten, ook meer duidelijkheid over complexe regulatie circuits in cellen (gebruikt om genexpressie profielen te begrijpen)
80
Hoe kun je eiwitmodificaties identificeren m.b.v. een massaspectometrie?
1. Eiwitmengsel behandelen met trypsine waardoor tryptische fragmenten ontstaan
2. Peptiden verrijken met een fosfaatgroep
3. Met een massaspectometrie de eiwitten identificeren
→ 1e piek is een eiwit zonder fosfaatgroep, 2e piek is hetzelfde eiwit zonder een fosfaatgroep –» kijkend naar de moleculaire massa van peptiden kan achterhaald worden welke peptiden gefosforyleert zijn (dit principe kan gedaan ook worden met toevoeging van andere groepen)
81
Hoe kun je m.b.v. metabolieten eiwitten analyseren?
Metabolieten als suikers, nucleotiden, aminozuren en vetten komen in het bloed, maar worden gemaakt door cellen en zo is te achterhalen wat er in de cellen gemaakt wordt
- aanwezigheid van bepaalde metabolieten kan mogelijk worden gebruikt in de vroege detectie van tumoren
Het idee was: misschien kun je al voordat de ziekte (tumor) naar buiten komt, deze detecteren doordat bepaalde metabolieten in een hogere concentratie in het bloed aanwezig zijn → biomarker proberen te vinden → eerder beginnen met behandelen
82
Hoe breng je een metaboloom in kaart?
1. Sample preparation
2. Massaspectometrie
3. Identificatie m.b.v. een computer
4. Herkennen van een patroon
5. Bepalen van de biomarker
83
Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)?
mRNA zorgt niet alleen voor eiwitactiviteit, maar ook voor:
- regulatie van eiwitmodificaties (fosforylering, etc.)
- regulatie van eiwitstabiliteit (afbraak door bepaalde proteases)
- regulatie van translatie (aantal eiwitten dat van een mRNA molecuul gemaakt wordt) op het niveau van microRNAs
84
Hoe wordt de translatie van mRNAs gereguleerd?
Op het DNA liggen genen die niet coderen voor eiwitten maar voor kleine stukjes RNA (microRNA) die de translatie van mRNA beïnvloeden, dit gebeurt in de volgende stappen:
1. Van DNA wordt een stuk RNA afgeschreven: primair micro-RNA (miRNA)
2. Drosha (enzymcomplex) knipt het tot pre-miRNA
3. Transport vanuit nucleus naar cytoplasma
4. Dicer knipt het complex tot miRNA (kort dubbelstrengs RNA)
5. 1 streng wordt ingebouwd in het RISC-complex
6. RISC-complex bindt aan een complementaire sequentie in het mRNA (meestal 3’)
7. miRNA zorgt voor specificiteit, binding vermindert de translatie van dat stuk RNA of zorgt voor meer mRNA afbraak
–> 1 miRNA kan soms binden aan verschillende mRNAs en zo meerdere eiwitten reguleren
85
Wat is het belang van microRNA voor kanker?
- bijna de helft van het microRNA-onderzoek richt zich op kanker; soms beïnvloed miRNA direct de expressie van kanker-gerelateerde genen
→ bijv. miRNA-16: miRNA16 komt verlaagd tot expressie in een aantal tumoren –> hierdoor zal BCL2 verhoogd zijn (–> apoptose remmen) en CDC25A verhoogd zijn (–> celcyclus progressie) –> samen leidt dit tot groei van kanker
- het analyseren ervan geeft een goede prognostische en diagnostische waarde
- i.c.m. mRNA microarray/sequencing, protemics en metabolomics krijg je veel informatie, echter is het wel erg duur
86
Hoe worden korte RNAs (siRNAs) gebruikt in onderzoek?
Stukje RNA die je zelf in het genoom kunt inbrengen en hierdoor mRNA kan afbreken waartegen het gericht is
1. Zodra dubbelstrengs RNA de cel inkomt, knipt het enzym dicer in korte stukjes (siRNA)
2. Deze kunnen worden ingebouwd in het RISC-complex
3. RISC-complex zal het dubbelstrengs-RNA in stukken gaan knippen
–> echter in de praktijk voor de therapie nog niet mogelijk om dit toe te passen (wel in het laboratorium)
87
Hoe kan je ingrijpen op de groei van kankercellen?
- Het eiwitproduct wegvangen: remmen van kinase activiteit van BCR-ABL-gen heeft wel nadelen; probleem met specificiteit waardoor makkelijk resistentie optreed en het probleem wordt niet bij de bron aangepakt (op DNA niveau)
- Ingrijpen via siRNAs op het niveau van mRNA (wat het afbreekt)
88
Hoe werkt RNA-interferentie (RNAi) en wat zijn de voor- en nadelen?
Principe:
1. Een hele hoop stukjes siRNAs verzamelen in een aparte celkweek
2. In elke celkweek een specifiek eiwit uitschakelen
3. Effect van de behandeling analyseren
4. Kijken welke siRNAs celdood voor kankercellen geven, maar niet voor normale cellen
5. Controleren of er al remmers voor deze targets zijn
6. Controleren of de remmer daadwerkelijk werkt in cellen/diermodellen
Voordelen: voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen, eenvoudig toe te passen op elk willekeurig gen waarvan men de sequentie weet (zeer specifiek), niet snel resistentie, geschikt voor hoge doorvoer analyses
Nadelen: alleen gebruikt om expressie te remmen, niet bekend hoe het in de gewenste cellen ingebracht wordt (heel misschien hiervoor virussen gebruiken –> onderzoek in DLBCL)
